【正文】 固體平板培養(yǎng)法 ： 將制備好的單細(xì)胞懸浮液，按照一定的細(xì)胞密度，與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，并平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法。 三、填空題： 植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方式主要有：分批培養(yǎng)法 ，連續(xù)培養(yǎng)法，半連續(xù)培養(yǎng)法和固定化培生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 2 養(yǎng)法 誘導(dǎo)植物細(xì)胞融合的因素主要有： PEG 誘導(dǎo)； NaNO3 誘導(dǎo)；高鈣和高 PH誘導(dǎo)；高鈣和高 PH 及 PEG 結(jié)合誘導(dǎo) 一般認(rèn)為形成的器官的類型受培養(yǎng)基中兩類激素的相對(duì)濃度的控制，較高濃度的 生長(zhǎng)素 有利于根的形成而抑制芽的形成，相反，較高濃度的 細(xì)胞分裂素 則促進(jìn)芽的形成而抑制根的形成。（由莖尖、腋芽、原球莖、塊莖、鱗莖等器官 發(fā)生）；（ 2）間接發(fā)生：外植體（已分化的成熟組織）經(jīng)脫分化形成愈傷組織再分化形成器官的過程。 愈傷組織： 脫分化后的細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無組織結(jié)構(gòu)、無明顯極性的、松散的細(xì)胞團(tuán)。生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 1 植物細(xì)胞工程 一、 專業(yè)符號(hào) 生長(zhǎng)素類： IAA 吲哚乙酸 IBA 吲哚丁酸 NAA 萘乙酸 2,4D 2,4二氯苯氧乙酸 細(xì)胞分裂素類： KT 激動(dòng)素 6BA（ 6BAP） 6芐基氨基嘌呤 ZT 玉米素 GA3 赤霉酸 ABA 脫落酸 醋酸酯熒光素（ FDA）染色法 DMSO 二甲基亞砜 二、名詞解釋 微室培養(yǎng)法 ： 人工制造一個(gè)小室，將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法。 細(xì)胞分化： 是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功 能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程 細(xì)胞懸浮培養(yǎng) (cell suspension culture)： 將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。 1 Ti 質(zhì)粒 ： 農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙鏈共價(jià)閉合的環(huán)狀 DNA 分子，有三個(gè)功能區(qū)： TDNA 區(qū)，病毒區(qū) (Vir 區(qū) )和冠癭堿代謝基因的編碼區(qū)。 植物原生質(zhì)體發(fā)育及植株再生途徑主要有：細(xì)胞壁再生；細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)；愈傷組織形成與分化；植株再生 制備植物原生質(zhì)體過程中，酶解去細(xì)胞壁時(shí)，為保證原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，常加入 滲透穩(wěn)定劑 (①糖溶液系統(tǒng)：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等；②鹽溶液系統(tǒng)：包括 KCl、MgS04 和 KH2PO4 等 )。用途 ：是為了分離單細(xì)胞無性系，研究其生理、生化的遺傳上的差異而設(shè)計(jì)的一種單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。特點(diǎn)：效果好，易于成功；簡(jiǎn)便易行；不能在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)過程； ④ 微室培養(yǎng) ： 人工制造一個(gè)小室，將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的方法。 植物細(xì)胞培養(yǎng)的植株再生步驟有哪些？ ： 離體培養(yǎng)的組織、細(xì)胞在誘導(dǎo)條件下經(jīng)分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的過程。 由外植體經(jīng)胚狀體形成完整植株可分三個(gè)不同發(fā)育階段： 1)外植體細(xì)胞脫分化 ： 外植體發(fā)生細(xì)胞分裂，或進(jìn)而形成愈傷組織。我們把由愈傷組織的類似薄壁組織細(xì)胞不經(jīng)有性過程而直接產(chǎn)生類似胚的這一結(jié)構(gòu)，稱為胚狀體。在洗脫過程中， PEG 將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排。 ② 電融合： 原理： 交流電場(chǎng)使原生質(zhì)體表面電荷偶極化，沿著電極排列，形成串珠 ； 施加直流電場(chǎng)后，形成串珠的原生質(zhì)體在質(zhì)膜接觸處發(fā)生穿孔，開始遺傳物質(zhì)的交流 優(yōu)點(diǎn)： ① 是不存在對(duì)細(xì)胞的毒害問題； ② 是融合效率高； ③ 是融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便。 ： 利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (TdT)轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能，將同種核苷酸（ dNTP)加到 DNA分子單鏈延伸末端的 3′ OH 上。 ： 大多數(shù)的細(xì)菌對(duì)于噬菌體的感染都存在一些功能性障礙，即所謂的寄主控制的限制(restriction)和修飾 (modification)現(xiàn)象，簡(jiǎn)稱 R/M 體系。 ： 指多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)。 11．插入滅活效應(yīng)： 外源性 DNA 克隆到插入型的λ載體分子上會(huì)使噬菌體的某些生物功能喪失，即所謂 插入滅活效應(yīng) 。 : 能從其周圍攝入 DNA 的細(xì)胞稱為感受態(tài)細(xì)胞。晚期基因區(qū)域取代方式是以外源 DNA片段取代晚期基因區(qū)域，構(gòu)成的重組 DNA在宿主中可以復(fù)制，但不能產(chǎn)生重組病毒顆粒，因而采用早期基因缺失的 SV40 病毒突變種作為輔助病毒與晚期取代重組 DNA 或和感染宿主，則晚期區(qū)域取代重組 DNA 可獲得標(biāo)記營(yíng)救，輔助病毒產(chǎn)生的晚期基因產(chǎn)物與重組病毒的早期基因產(chǎn)物一起可形成完整病毒顆粒。獲得具有新遺傳性狀的生物細(xì)胞的過程。該 Iq 突變基因可產(chǎn)生出 10 余倍超量的阻遏物。 接頭法（ adaptor） ： 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 6 是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。 。 基本步驟 ①獲得目的基因 ； ②在體外，將帶有目的基因的外源 DNA 片段連接到能自我復(fù)制并具有選擇性標(biāo)記的載體分子上，形成重組 DNA 分子；③將重組 DNA 分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，并與之一起增殖；④從大量細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得重組 DNA 分子的宿主細(xì)胞克??；⑤從這些篩選出來的宿主細(xì)胞克隆中，提取出已經(jīng)得到擴(kuò) 增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究用；⑥將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。 Col E1 質(zhì)粒載體 ； pSC101 質(zhì)粒載體 ； pBR322 質(zhì)粒載體 ； pUC 質(zhì)粒載體 ； λ噬菌體 DNA 克隆載體；科斯質(zhì)粒載體；單鏈 DNA 噬菌體 M13 載體。 四、問答題 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 7 ？各有哪些特點(diǎn)？ ① 基因分離的物理方法 ： 根據(jù) DNA 分子的兩條鏈存在著 G≡ C， A=T 堿基配對(duì)。 ② 鳥槍法 (Shot gun) 又稱霰彈法 :：操作簡(jiǎn)單，命中率較高 。 ④ 基因組文庫法 :從基因組文庫所分離獲得的基因序列包含有內(nèi)含子，因此不能直接在原核細(xì)胞中表達(dá)，但更適合作為如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等的真核表達(dá)系統(tǒng)。 .缺點(diǎn)：必須對(duì)基因的結(jié)構(gòu)序列清楚。 RNA和 mRNA。 cDNA 與載體的連接 。 的穩(wěn)定性與基因高效表達(dá)： ①利用 RNase 缺失的受體菌 。 :真核細(xì)胞與原核細(xì)胞對(duì)遺傳密碼的偏倚性不同，在 不同表達(dá)系統(tǒng)中，使用偏倚性密碼 ，尤其對(duì)于基因編碼序列的 5′ 端使用偏倚性密碼，能有效提高表達(dá)效率 。 ②用一串連的終止密碼，而不是只是一個(gè)終止生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 8 密碼，以保證翻譯有效終止 。 DNA 片段的連接有哪些方法，各有什么特色？ A. 同聚物加尾法 : 優(yōu)點(diǎn)： 是 連接任 何兩段 DNA 分子的普遍性方法 ； 缺點(diǎn) ：插入的片段難以回收。 （ 克服的方法是將 5?末端的磷酸修飾移去，其結(jié)果為暴露出的 5‘OH所取代。 2． 基因工程新技術(shù) ：蛋白質(zhì)工程，反義藥物， RNAi 技術(shù)，新生物技術(shù)疫苗。 PCR 反應(yīng)的必要條件 ：須知基因兩端的部分序列 PCR 反應(yīng)中的幾個(gè)關(guān)鍵因素 ： Taq DNA 聚合酶 ； 引物的長(zhǎng)度 ； 模板 。 以固定化的 生物成分（如酶、蛋白質(zhì)、 DNA、抗體、抗原）或微生物體本身（如細(xì)胞、微生物、組織等）為敏感材料，與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)換能器相結(jié)合，用于快速檢測(cè)物理、化學(xué)、生物量的新型器件 生物技術(shù)復(fù)習(xí)題 07437 10 酶在非水相（也稱為非水介質(zhì)）中也具有催化活性，可以在含有多種有機(jī)溶劑和微量水分的非水介質(zhì)中發(fā)揮催化作用 抗體酶又稱催化抗體（ catalytic antibody），是一類具有抗體的高度特異性又具有酶的高效催化活性的蛋白質(zhì)分子 能在極端環(huán)境中生長(zhǎng)的微生物 叫做極端微生物。 三、 問答題 ？什么是酶工程？ 酶具有以下特性： 酶是蛋白質(zhì)； 酶的催化效率非常高 ； 酶具有高度的專一性； 酶的反應(yīng)條件溫和（常溫、常壓） ； 酶的催化活性受到調(diào)節(jié)和控制。酶與載體之間結(jié)合力不強(qiáng)，酶易于脫落，導(dǎo)致酶活力下降并污染產(chǎn)物。 本法又分為（ 1）交聯(lián)酶法、（ 2）酶與輔助蛋白交聯(lián)法、（ 3）吸附交聯(lián)法、（ 4）載體交聯(lián)法 ④ 包埋法 ： 分為凝膠包埋法及微囊化包埋法兩類 優(yōu)點(diǎn)： 制備固定化酶的操作條件溫和，不改變酶的結(jié)構(gòu)，操作時(shí)保護(hù)劑及穩(wěn)定劑均不影響酶的包埋率，適用于多種酶、粗酶制劑、細(xì)胞器及細(xì)胞的固定化。 ? ① 競(jìng)爭(zhēng)性抑制 ： 與底物結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)能在酶的活性部位與酶結(jié)合，使酶促反應(yīng)速率下降 ② 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制： 抑制劑可在酶的活性部位以外與酶結(jié)合，其結(jié)合與底物沒有 競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系 ③ 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制 ： 抑制劑 I 僅與復(fù)合物 ES 作用生成底物 酶 抑制劑復(fù)合物 SEI ？ 從一個(gè)或多個(gè)已存在的親本出發(fā)，利用 TaqDNA 多聚酶不具有 3‘→ 5‘校對(duì)功能，并結(jié)合基因工程現(xiàn)有技術(shù)，在待進(jìn)化的酶基因的 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中，配合適當(dāng)條件，以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變，并構(gòu)建突變庫。 此法可以避免酶反應(yīng)過程的底物抑制現(xiàn)象 ③ 連續(xù)式反應(yīng)器： 一邊連續(xù)地將底物溶液加入反應(yīng)器中，一邊連續(xù)地使反應(yīng)液以相同流量排出反應(yīng)器 。 能提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱為誘變劑 指遺傳物質(zhì)（ DNA 或 RNA）中的核苷酸順序突然發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的變化 （ Gene rebination） 指兩個(gè)不同性狀個(gè)體的遺傳基因轉(zhuǎn)移到一個(gè)個(gè)體細(xì)胞內(nèi)，并經(jīng)過基因的重新組合后，造成菌種變異，形成新的遺傳型個(gè)體的方式 用脫壁酶處理將微生物細(xì)胞壁出去，制成原生質(zhì)體，再用聚乙二醇（ PEG）促進(jìn)原生質(zhì)體發(fā)生融合，從而獲得融合子，這一技術(shù)叫原生質(zhì)體融合 原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上重新長(zhǎng)出細(xì)胞壁，以恢復(fù)細(xì)胞原有的形態(tài)和功能 微生物 在生活條件發(fā)生改變時(shí)，發(fā)生暫時(shí)的形態(tài)、生理等特性的改變，但隨著環(huán)境條件的復(fù)原，它們又恢復(fù)了原有的特性，這種變異沒有使遺傳物質(zhì) 發(fā)生任何變化，而僅是表型的改變，是不可遺傳的變異 代謝工程是指利用多基因重組技術(shù)有目的地對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，改變細(xì)胞特性，并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一個(gè)新的學(xué)科領(lǐng)域。 PH 、 基質(zhì)濃度 、 溶解氧濃度 、 氧化還原電位 、 產(chǎn)物濃度 、 廢氣中的氧濃度 和 廢氣中的 CO2濃度 。 ② 天然培養(yǎng)基： 它的原料是一些天然的動(dòng)植物產(chǎn)品，如花生餅粉、酵母膏