【正文】 的靶子序列也各不相同，但都產(chǎn)生出相同的粘性末端，稱為同尾酶。 ： 是基因的一個組成部分，控制基因表達（轉(zhuǎn)錄）的起始時間和表達程度，是位于結(jié)構(gòu)基因 5′端上游的一段 DNA 序列，能 夠指導(dǎo)全酶同模板正確結(jié)合，活化 RNA 聚合酶，啟動基因轉(zhuǎn)錄。 ： 指多個限制性內(nèi)切酶的單一切點。由許多限制酶切點組成，往往是人工合成的一段外源基因的插入部位的 DNA 序列。 ： 識別順序與切割方式均相同者，為之同裂酶。 （ linker） ： 生物技術(shù)復(fù)習題 07437 5 將銜接物的 5′ 末端和待克隆的 DNA 片段的 5′ 末端用多 核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后通過 T4DNA 連接酶的作用是兩者連接起來，接著用適當?shù)南拗泼赶咩暯游锏?DNA 分子和載體分子，由此使兩者都產(chǎn)生出彼此互補的粘性末端。 11．插入滅活效應(yīng)： 外源性 DNA 克隆到插入型的λ載體分子上會使噬菌體的某些生物功能喪失，即所謂 插入滅活效應(yīng) 。 : 是指通過蛋白質(zhì)化學(xué)、晶體學(xué)和動力學(xué)的研究，獲取關(guān)于蛋白質(zhì)物理、化學(xué)等各方面的信息，在此基礎(chǔ)上，對編碼該蛋白質(zhì)的基因進行有目的的改造，并 通過基因工程等手段將其進行表達和分離純化，最終得到比天然蛋白質(zhì)更好的產(chǎn)物。 : 利用抗原 抗體反應(yīng)來檢測含目的基因的重組轉(zhuǎn)化體或嗜斑的技術(shù)稱為免疫分析法。 條件：只要目的基因在宿主中表達相應(yīng)蛋白質(zhì)，并能獲得相應(yīng)抗體，即可用本技術(shù)檢測相應(yīng) DNA。 : 能從其周圍攝入 DNA 的細胞稱為感受態(tài)細胞。 基因工程中，宿主細胞需經(jīng)人工處理成能吸收重組 DNA 分子的敏感狀態(tài)，才能用于轉(zhuǎn)化，這種敏感細胞稱為人工感受態(tài)細胞。 : 根據(jù)核酸雜交原理，利用基因探針檢出培養(yǎng)板上重組 轉(zhuǎn) 化體菌落位置的技術(shù)稱之為原位雜交技術(shù)。 ： SV40DNA 為載體的取代克隆方式分為早期基因區(qū)域取代及晚期基因區(qū)域取代兩種類型。晚期基因區(qū)域取代方式是以外源 DNA片段取代晚期基因區(qū)域，構(gòu)成的重組 DNA在宿主中可以復(fù)制，但不能產(chǎn)生重組病毒顆粒，因而采用早期基因缺失的 SV40 病毒突變種作為輔助病毒與晚期取代重組 DNA 或和感染宿主，則晚期區(qū)域取代重組 DNA 可獲得標記營救，輔助病毒產(chǎn)生的晚期基因產(chǎn)物與重組病毒的早期基因產(chǎn)物一起可形成完整病毒顆粒。 ： 是指用化學(xué)方法合成的一段由 1012 個核 苷酸組成，具有一個或數(shù)個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸段片斷。 ： 所謂基因組文庫是將基因組 DNA通過限制性內(nèi)切酶部分酶解后所產(chǎn)生的基因組 DNA片段隨機地同相應(yīng)的載體重組、克隆，所產(chǎn)生的克隆群體代表了基因組 DNA 的所有序列。 Transformation: 自然的轉(zhuǎn)化是指將攜帶某種遺傳信息的 DNA 分子引入宿主細胞，通過同源重組作用。獲得具有新遺傳性狀的生物細胞的過程。 基因工程操作中的轉(zhuǎn)化是泛指將重組 DNA 轉(zhuǎn)入宿主中的方法。 ： 位點上核苷酸順序通常呈雙重旋轉(zhuǎn)對 稱結(jié)構(gòu)，即呈回文結(jié)構(gòu)。 : 在 M13 體系中，已將 Lac 阻遏基因的 Iq 突變引入宿祖細胞。該 Iq 突變基因可產(chǎn)生出 10 余倍超量的阻遏物。這些阻遏物的存在可以抑制 Lac 操縱子的表達。 IPTG 是一種乳糖類似物，再無乳糖的條件下，他可以誘導(dǎo)細胞合成半乳糖苷酶。因此， IPTG 被稱為β半乳糖苷酶的安慰誘導(dǎo)物。 接頭法（ adaptor） ： 生物技術(shù)復(fù)習題 07437 6 是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。 當它 的平末端與平末端的外源 DNA 片段連接后，便會使后者成為具有粘性末端的新 的DNA 分子，而易于連接重組。 : DNA蛋白質(zhì)篩選法是用來專門檢測同 DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子的中的外源 DNA編碼一種能專門同某一特定 DNA 序列結(jié)合的 DNA 結(jié)合蛋白質(zhì) . 三、 填空題 : 。能自主復(fù)制 。 。，裝卸手續(xù)簡單 。小不同的外源性目的基因、載體分子量要小 ,載力要大 。、安全可靠、穩(wěn)定性好 . DNA 轉(zhuǎn)入宿主細胞的 方法 ① CaCl2 處理后的細菌轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染； ②高壓電穿孔法；③聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化；④磷酸鈣或 DEAE葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；⑤原生質(zhì)體融合；⑥脂質(zhì)體法；⑦細胞核的顯微注射法；⑧激光打孔技術(shù)。 基本步驟 ①獲得目的基因 ； ②在體外，將帶有目的基因的外源 DNA 片段連接到能自我復(fù)制并具有選擇性標記的載體分子上，形成重組 DNA 分子；③將重組 DNA 分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)乃拗骷毎?，并與之一起增殖；④從大量細胞繁殖群體中，篩選出獲得重組 DNA 分子的宿主細胞克??；⑤從這些篩選出來的宿主細胞克隆中，提取出已經(jīng)得到擴 增的目的基因，供進一步分析研究用；⑥將目的基因克隆到表達載體上，導(dǎo)入宿主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。 表達系統(tǒng)中常用的強啟動子 Lac Trp λ PL λ PR 基因制備方法 ①基因分離的物理方法 ； ②鳥槍法；③ cDNA 文庫的建立與基因分離；④基因組文庫法；⑤基因的化學(xué)合成；⑥聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（ PCR）。 ① 有效的轉(zhuǎn)錄起始； ② mRNA 的穩(wěn)定性； ③ 有效地翻譯啟始； ④ 遺傳密碼應(yīng)用的偏倚性； ⑤ mRNA 的加工； ⑥ mRNA 序列上終止密碼的選擇；⑦表達質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性；⑧外源基因的穩(wěn)定性。 主要步驟： 高溫變性；低溫退火；適溫延伸。 Col E1 質(zhì)粒載體 ； pSC101 質(zhì)粒載體 ； pBR322 質(zhì)粒載體 ； pUC 質(zhì)粒載體 ； λ噬菌體 DNA 克隆載體；科斯質(zhì)粒載體；單鏈 DNA 噬菌體 M13 載體。 片段的連接方法 平頭 雙鏈 DNA 分子的連接（ T4DNA 連接酶）；粘性末端 DNA 片段的連接（ DNA 連接酶）；平末端 DNA 片段的連接（同聚物加尾法，銜接物連接法， DNA 接頭連接法）。 : ① 有很高的拷貝數(shù)； ② 強大的啟動子，可保證外源基因的高效表達； ③ 可保證糖基化。 ，主要表達方式 非融合蛋白的胞內(nèi)表達；融合蛋白的胞內(nèi)表達；分泌表達。 四、問答題 生物技術(shù)復(fù)習題 07437 7 ？各有哪些特點？ ① 基因分離的物理方法 ： 根據(jù) DNA 分子的兩條鏈存在著 G≡ C， A=T 堿基配對。如 DNA 分子中某段的 G≡ C 堿基對含量高，則其熱穩(wěn)定性就高，其溶解溫度（ Tm）就高。 通過控制溶解溫度使富 A=T 區(qū)解鏈變性，而富 G≡ C 區(qū)仍維持雙鏈。當利用單鏈核酸酶 S，酶去除解開的單鏈部分，得到富 G≡ C 區(qū)的 DNA 片段 。 ② 鳥槍法 (Shot gun) 又稱霰彈法 :：操作簡單，命中率較高 。：盲目性大，陽性片段不一定正好是基因，樣本多，可能會漏。 ③ cDNA 文庫的建立與基因的分離 :是以 mRNA 為模版，用反轉(zhuǎn)錄酶合成互補 DNA 的方法。 cDNA文庫最關(guān)鍵的特征是它只包括在特定的組織或細胞類型中已經(jīng)被轉(zhuǎn)錄成 mRNA的那些基因序列 。 ④ 基因組文庫法 :從基因組文庫所分離獲得的基因序列包含有內(nèi)含子，因此不能直接在原核細胞中表達，但更適合作為如轉(zhuǎn)基因動物等的真核表達系統(tǒng)。 ⑤ 基因的化學(xué)合成 :優(yōu)點 : 。 。以在兩端加上需要的限制酶切點 。 .缺點：必須對基因的結(jié)構(gòu)序列清楚。 ⑥ 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（ PCR） :優(yōu)點： 。 。 . 文庫的建立有哪些步驟 ? 。 RNA和 mRNA。 cDNA鏈的合成 。 cDNA 鏈的合成 。 上接頭的加入 。 cDNA 與載體的連接 。多的重組體中篩選出特定的基因 . 名原則是什么 ? 凡能識別并切割雙螺旋 DNA 分子內(nèi)特定核苷酸順序的酶統(tǒng)稱為限制酶。 命名原則：屬 —— 種 —— 株 —— 分離序號 例如： EcoRⅠ 屬： Escherichia 種： coli 株： R 分離序號：Ⅰ 第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細菌屬名，用大寫；第二，第三個字母是該細菌的種名，用小寫； 第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。 ** ：選擇強的可調(diào)控的啟動子 。 的穩(wěn)定性與基因高效表達： ①利用 RNase 缺失的受體菌 。② mRNA的 5′ 端與 3′ 端的正確加工，提高 mRNA 的穩(wěn)定性 。 : ①首選 AUG 為起始密碼子；②正確的 SD 序列；③ SD序列與起始密碼子之間的距離以 9177。 3 為宜；④除 SD 序列外，處于起始密碼 5′ 端的核苷酸應(yīng)為 A 和 U；⑤如果在起始密碼 AUG 后的序列是 GCAU 或 AAAA，能使翻譯效率提高； ⑥在翻譯起始區(qū)周圍的序列應(yīng)不形成明顯的二級結(jié)構(gòu) 。 :真核細胞與原核細胞對遺傳密碼的偏倚性不同，在 不同表達系統(tǒng)中，使用偏倚性密碼 ，尤其對于基因編碼序列的 5′ 端使用偏倚性密碼，能有效提高表達效率 。 的加工與基因高效表達 :絕大多數(shù)較高等的真核基因含有內(nèi)含子，這些內(nèi)含子在 mRNA的加工過程中，在細胞核中被加工去除而產(chǎn)生成熟的 mRNA。但許多哺乳動物類細胞中外源基因的表達需要內(nèi)含子存在，如果在轉(zhuǎn)基因動物中表達外源基因時，最好用基因組基因而非cDNA。 序列上終止密碼的選擇 : ①首選 UAA。 ②用一串連的終止密碼，而不是只是一個終止生物技術(shù)復(fù)習題 07437 8 密碼，以保證翻譯有效終止 。 :一般來講：①質(zhì)?？?貝數(shù)多，基因表達水平高；②表達質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性與基因高效表達 。 : ①通過組建融合基因，產(chǎn)生融合蛋白；②產(chǎn)生可分泌的蛋白質(zhì)；③以包含體的形式表達；④選擇合適的宿主表達系統(tǒng)。 人 的 β 珠蛋白，必須經(jīng)過幾個基本步驟 (參考填空題 3 題 ) 獲得目的基因序列（過程，方法） —— 設(shè)計引物 —— （ PCR 擴增，文庫法， cDNA） —— 選擇載體 —— 宿主 —— 篩選 —— 發(fā)酵培養(yǎng) —— 分離純化。 DNA 片段的連接有哪些方法，各有什么特色？ A. 同聚物加尾法 : 優(yōu)點： 是 連接任 何兩段 DNA 分子的普遍性方法 ； 缺點 ：插入的片段難以回收。無法控制外源基因插入方向 ； B. 銜接物 連接法 :優(yōu)點 ：克隆后還可回收原插入片斷 ； 缺點 ： 如果待克隆的 DNA 片段或基因的內(nèi)部也含有與所加的銜接物相同的限制位點，這樣在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時，也會把所克隆的基因切成不同的片段