【文章內(nèi)容簡介】 IgG 或 IgM 作為二抗用于 ELISA)亞類的確定需要用標準抗亞類血清系統(tǒng)做雙擴散電泳或夾心 ELISA。 ? 其他鑒定： 中和活性鑒定；識別抗原表位鑒定；親和力鑒定；效價 (滴度鑒定 )；純度鑒定 ? 雜交瘤細胞的鑒定：主要是對雜交瘤細胞進行染色體分析 抗體治療疾病的機制 ：中和作用、導向作用、拮抗作用、 ADCC、 CD、 Aonist 抗體在疾病治療中的應用 ? 作為診斷試劑： 病原微生物抗原抗體的檢測、腫瘤抗原的檢測、免疫細胞及其亞群的檢測、激素測定、細胞因子的測定 ? 作為治療藥物： 抗腫瘤、抗感 染、抗器官移植排斥反應、治療自身免疫性疾病和變態(tài)反應性疾病 制約抗體藥物迅速發(fā)展的主要障礙 ：免疫原性；分子量大 基因工程抗體 ? 單克隆抗體的人源化 ? 嵌合抗體： 人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。 特點： 具備親本鼠源單抗相同的特異性和親和力；對人的免疫原性大大減少；可以接上不同亞類的人 C 區(qū)基因，改變抗體功能；半衰期長；工程細胞系比人－人雜交瘤細胞穩(wěn)定；由于鼠 VL 和 VH 區(qū)的存在，仍有較強免疫原性 ? 改形 (型 )抗體： 把鼠抗體的 CDR 序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱 CDR 移植抗體或改形抗體，也就是人源化抗體。，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變， ? 小分子抗體 ? 包括 Fab、 Fv、單鏈抗體及單域抗體等 ? Fab 片段 ：由重鏈 V 區(qū)及 CH1 功能區(qū)與完整的輕鏈以二硫鍵連接而成。 1/3 ? Fv 片段： 由 VH 與 VL 非共價結(jié)合而成。在 VH 與 VL的適當區(qū)域個引入一個半胱氨酸，形成鏈內(nèi)二硫鍵，成為 二硫鍵穩(wěn)定的 Fv(disulfidestablized Fv， dsFv)1/6 ? 單鏈抗體 (ScFv)：在 VH 與 VL 之間加上一段連接肽，把 VH 與 VL 連成一條單鏈，即 單鏈抗體 。常用的 連接肽是 (GGGGS)3 ? 單域抗體： 即為 VH 或 VL，約為完整分子的 1/12。它只由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。 ? 優(yōu)點 ：可以用細菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低；分子小，穿透力強；不含 Fc，沒有 Fc 帶來的效應；在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標抗體等。 ? 多功能化抗體 ? 雙功能抗體 (bsAb)： 又稱雙特異性抗體，兩個針對不同抗原決定簇的 ScFv 以共價鍵或非共價鍵連接在一起。 ? 融合抗體： Fc 抗體融合蛋白； Fv 抗體融合蛋白 ? 細胞內(nèi)抗體： 指在細胞內(nèi)合成并作用于細胞內(nèi)組分的抗體，也稱內(nèi)抗體。在 scFv 的 C 端 /N 端插入其他靶向信號 ? 最小識別單位： 約為完整分子的 1/801/70 大小，一般由一個 CDR 構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性 噬菌體抗體工程 噬菌體抗體庫技術的三個關鍵 ： RTPCR 技術；噬菌體展示技術；抗體原核表達技術 。 ★ 噬菌體抗菌庫技術的篩選 ： 。固相或液相純化抗原的篩選、全細胞篩選、用切片組織進行篩選 第五章 疫苗及其制備技術 (live vaccine)選用無毒或弱毒但免疫原性高的菌種，經(jīng)培 養(yǎng)、繁殖后制成的?；钜呙缰赀M入機體后，能繼續(xù)生長繁殖，對機體呈長時間刺激，持續(xù)產(chǎn)生抗體。這類菌 (疫 )苗有 卡介菌 (預防結(jié)核病的菌苗 )、 炭疽菌苗 、 牛痘疫苗 、狂犬病疫苗、 鼠疫菌苗 、 脊髓灰質(zhì)炎疫苗 以及 麻疹苗 等。 (killed vaccine)包括 滅活疫苗 (由完整的病毒或細菌經(jīng)滅活劑滅活后制成，即要使病原體充分死亡，喪失感染性或毒性和致病性，又要保留其免疫原性 )和 亞單位疫苗 (將病原體經(jīng)物理或化學方法處理，除去無效物質(zhì)，提取其有效抗原部分制備的一類疫苗 ) ★活疫苗特點★ ★死疫苗特點★ ? 可在體內(nèi)繁殖 ? 系 統(tǒng)免疫反應和局部免疫反應 ? 免疫力持久 ，產(chǎn)量高， 成本低 ? 有毒力增強和反祖危險 ? 抗原干擾現(xiàn)象 ? 保存條件苛刻 ? 不能在體內(nèi)繁殖 ，性質(zhì)穩(wěn)定， 安全性高 ? 有利于制備多價或多聯(lián)疫苗 ? 比較安全，不發(fā)生全身性副反應，無毒力反祖現(xiàn)象 ? 受外界影響小，有利于保存運輸 ? 免疫劑量大， 需多次免疫，成本高 ? 只能誘導機體產(chǎn)生體液免疫 ? 通常 需要用佐劑或攜帶系統(tǒng)來增強其免疫效果 ★ 活疫苗 ★ 死疫苗 DNA 疫苗 ? 可在宿主細胞中復制 ? 毒力降低 ? 免疫反應比較全面 ? 免疫劑量小 ? 免疫保護期長 ? 不能在宿主細胞中復制 ? 無毒，不返強 ? 免疫反應不太全面 ? 不會 傳染給其它個體 ? 制備技術相對容易 ? 可刺接抗原在細胞內(nèi)合成 ? 可誘導細胞免疫 ? 制備技術容易標準化 重組亞單位疫苗 ? 將病原的 主要保護性抗原蛋白基因 在體外進行大量表達，純化其表達產(chǎn)物輔以 佐劑 制成疫苗 亞單位疫苗 ? 良好的安全性和穩(wěn)定性。利用非疫苗用蛋白作為抗原建立的診斷方法將可以區(qū)分 亞單位疫苗免疫的動物 和自然感染的動物 ? 適用于發(fā)病快，病程急，中和抗體能有效控制發(fā)病的傳染病。 ? 不適于病程發(fā)展緩慢，潛伏期長，感染巨噬細胞且有 ADE 效應的疾病。 活載體疫苗 ? 利用低致病力的 痘病毒、皰疹病毒、腺病毒或細菌 作為載體，將 其它病原的主要保護性抗原基因插入到載體基因組的非必需區(qū)形成新的重組體，在同源或兼容性好的啟動子驅(qū)動下隨載體的復制表達插入的外源基因。 病毒活載體疫苗的缺點 ： 使用同一載體的不同疫苗不能同時使用 疫苗制造流程 制造優(yōu)良疫苗的關鍵： 優(yōu)良的菌種；適宜的培養(yǎng)方法；良好生產(chǎn)工藝；嚴格的檢驗和標準。 生產(chǎn)工藝流程： 菌 (毒 )種→培養(yǎng)物 (培養(yǎng)基、動 物、禽胚或細胞等 )→收獲抗原 (培養(yǎng)液、含毒組織、胚液或細胞液等 )→配苗→分裝→凍干成活疫苗或滅活后制成滅活疫苗。 毒種的選擇與減毒 ★ 毒株須具備的條件： 1) 持有特定 的抗原性； 2) 有典型的形態(tài)和感染特定組織的特性，并能保持其生物學特性； 3) 易在特定組織中大量繁殖； 4) 不產(chǎn)生神經(jīng)毒素或能引起機體損害的其它毒素； 5) 如制備活疫苗，繁殖過程中無恢復原致病性的現(xiàn)象； 6) 未被其它病毒污染。 強毒種的選育： 毒力強，純粹，抗原好，穩(wěn)定的菌種 ，最后凍干保藏。這就是 強毒菌種的標準 弱毒種的選育： 初選的依據(jù)：生物性狀改變 細菌滅活疫苗制造 ： 種子→培養(yǎng)→滅活和無菌檢查→濃縮提高含菌量→配佐劑→分裝→動物安全試驗 細菌弱毒疫苗制造： 菌種→培養(yǎng)→濃縮→配苗和凍干→動物安全試驗 病毒性動物組織苗 (自家組織 滅活苗；病毒弱毒疫苗 )、 病毒禽胚疫苗 、 病毒細胞疫苗 、 寄生蟲疫苗的制備 ★ 疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量檢定 ： 外觀檢查、 pH 值檢測、純度、宿主細胞 DNA 和蛋白殘留量、無菌檢查、熱原、抗生素檢測、滅活效果的驗證、異常毒性檢查、穩(wěn)定性試驗、效力試驗 (生物效價 )、佐劑的質(zhì)量評價、疫苗標準品或參考品的研究 甲型肝炎減毒活疫苗 ： 生產(chǎn)用細胞 (人二倍體細胞 )、細胞庫管理及檢定、細胞制備、細胞培養(yǎng)液、毒種名稱及來源、種子批的建立、對照細胞外源因子檢查、病毒接種和培養(yǎng)、病毒提取 (檢定合格的病毒收獲物經(jīng)凍融和 (或 )超聲波處理，并采用適宜濃 度的 三氯甲烷 抽提以提純病毒 )、原液 (同一細胞批生產(chǎn)的病毒收獲物經(jīng)提取病毒后合并為 一批原液 ) 流行性乙型腦炎疫苗 ：收液作毒力滴定與無菌實驗， 加入福爾馬林， 22℃恒溫滅活 8d 滅活劑、保護劑和免疫佐劑 滅活劑種類 1. 甲醛溶液 ：最常用。①蛋白質(zhì) ②核酸烷基化 (不加中斷劑 )作用于氨基、羧基、羥基、巰基 2. 烷化劑 ：乙酰基乙烯亞胺 (AEI)；二乙烯亞胺 (BEI)； 縮水甘油醛。 (使微生物核酸烷基化 ,滅活后加 2%硫代硫酸鈉中斷滅活 )。 烷化 DNA 分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤等，妨礙 RNA 的合成 。 使病毒完全喪失感染力 ，而保留其保護性抗原 。 3. 苯酚 (石炭酸 )：用于防腐， 很少用于疫苗研制 4. 結(jié)晶紫 ：蛋白質(zhì)變性 (溶于有機溶劑 )；用于診斷抗原的制備：雞白痢抗原 5. β丙酰內(nèi)酯 ： 病毒滅活劑，主要用于狂犬病滅活苗制備 ！注意 ：滅活劑對人有害， 有時對皮膚粘膜有強烈刺 激性如：甲醛、β 丙酰內(nèi)酯 影響滅活作用的因素 ： 滅活劑特異性；微生物種類和特性；滅活劑濃度；滅活溫度；滅活時間；滅活 PH 值；有機物存在 保護劑的用途 ① 菌種或毒種保存：常用甘油作保護劑 ② 細胞株保存：常用二甲基亞砜 (DMSO，一種細胞的保護劑 ) ③ 疫苗冷凍真空干燥制備時：加脫脂乳 (或二甲基亞砜 )和蔗糖等 (不同國家有不同配方 ) ④ 干擾素類生物活性物質(zhì)的保存：加葡聚糖 保護劑分類： 機理 —— 滲透劑 (DMSO、甘油和蔗糖 )非滲透劑 (聚乙烯吡咯啶酮 (PVP)和蛋白質(zhì) )； 分子量大小—— 高分子物質(zhì)、低分子物質(zhì)； 化學性質(zhì) —— 復合物、糖類、鹽類、醇類、酸類和聚合物 疫苗凍干保護劑組成 ：營養(yǎng)液；賦形劑；抗氧化劑 常用的凍干保護劑 (穩(wěn)定劑 ) ? 細菌的保護劑 ① 需氧或兼氧厭氧菌： ５％蔗糖脫脂乳 或 ５％蔗糖、 ％明膠 ； ② 厭氧性細菌：含 ％谷氨酸鈉的１％乳糖或 10％脫脂乳或 ％葡糖血清。 注：脫脂乳： 20％脫脂奶粉溶于水配制而成。 ? 病毒的保護劑 ① 5%蔗糖脫脂乳； ②馬立克 814 活細胞疫苗：保存液氮 .穩(wěn)定劑為 10%二甲基亞砜和 50%犢牛血清的 199 液。 注 : 微生物保護劑緩沖液的組成比例，不同廠家有不同的配方。 常用的保護劑： 5%蔗糖 (乳糖 )脫脂乳保護劑 ；明膠蔗糖保護劑； SPGA 保護劑 免疫佐劑： ? 氫氧化鋁膠 (鋁膠 ) ?油乳佐劑 ?乳化劑 ?白油佐劑 ?蜂膠佐劑 ?脂質(zhì)體佐劑 ? 細胞因子類免疫 佐劑 (IL IL IL1 IFNγ) ? CpG DNA(指含有非甲基化 CpG(胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸 )基序的脫氧核糖核酸 DNA) ? CpG OND(含有非甲基化 CpG基序的寡聚脫氧核苷酸 ) ? 基因工程減毒素 (霍亂毒素， CT；大腸桿菌不耐熱毒素， LT；破傷風類毒素， TT) ? 免疫刺激復合物 (ISCOM，抗原：糖苷 Quil A：膽固醇 =1:1:1) 作用機理： 抗原遞呈；抗原尋的；免疫調(diào)節(jié) ? CpGDNA 對多種免疫細胞有激活作用： 引起 B 細胞分化，直接激活單核細胞、巨噬細胞和樹突細胞，在 IL12 協(xié)同下激活 NK 細 胞，協(xié)同刺激抗原特異性 B細胞和 T 細胞分化 ? CpGODN 的體內(nèi)效應與應用： 對天然免疫系統(tǒng)的刺激活性 (抗感染、抗腫瘤活性 )；對特異性免疫反應的調(diào)節(jié)作用 —— 疫苗佐劑 (對蛋白質(zhì)抗原的作用；對 DNA 疫苗的作用 )；過敏性疾病治療 第六章 酶工程制藥 概述 酶是一類具有催化活性的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸 一般催化劑的特征 ： ； ，而不改變反應的平衡點； 。 ★ 酶的特點 ： 高效性、專一性、反應條件溫和、可調(diào)節(jié)性。 酶的分類 ： 六大類， 氧化還原酶類 (脫氫酶、氧化酶、過氧化物酶、羥化酶以及加氧酶類 )、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶類 (淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶 )、裂解酶類 (醛縮酶、水化酶及脫氨酶 )、異構(gòu)酶類 (消旋酶、順反異構(gòu)酶 )和 合成酶類 (又稱為連接酶 ) 酶的來源和生產(chǎn) ： 直接從動植物獲得，即從生物體中分離和提純；化學合成方法；工業(yè)微生物發(fā)酵 發(fā)酵法產(chǎn)酶的優(yōu)點 ：微生物種類繁多，制備出的酶種類齊全。微生物繁殖快，生產(chǎn)周期短，酶的產(chǎn)量高，成本低。微生物具有較強的適應性和應變能力，可以通過適應、誘導、誘變以及基因工程等方法培育出新的高產(chǎn)酶 的菌株。 研究內(nèi)容 ： 酶的大量生產(chǎn)和分離純化；新穎酶的發(fā)現(xiàn)、研究和應用；酶的固定化技術和 固定化酶反應器 ；基因工程技術應用于酶制劑的生產(chǎn)；酶分子改造與化學修飾；有機介質(zhì)中酶的反應；酶抑制劑、激活劑的開發(fā)及應用研究；抗體酶、核酸酶的研究；模擬酶、合成酶的研究；酶的定向進化研究 酶的分離純化 分離純化遵循蛋白質(zhì)分離純化的一般原則，但又有特殊性： ? 低溫：一般 1～ 4℃ ? 條件溫和：避免極端條件 (劇烈攪拌、 pH、鹽濃度等 ) ? 加入保護劑： EDTA、 2巰基乙醇等 ? 對純化過程進行監(jiān)測：不斷檢測酶活力和蛋白濃度 ★ 酶 分離純化的步驟 ： 預處理→初步純化→高度純化→濃縮與干燥 ? 酶的提取 ? 來源選擇 ： 含目的多的原料。同時考慮原料的來源、取材方便經(jīng)濟等方面因素 ? 細胞破碎 ：機械法、物理法、化學法 (有機溶劑、表面活性劑 )、生物法 (酶解 ) ? 保護措施： 采用緩沖系統(tǒng)；添加保護劑；抑制水解酶的作用；其他：注意溫度、攪拌、紫外光等的影響 ? 酶的抽提：