生物技術(shù)制藥ppt課件(2)(編輯修改稿)
2025-02-04 04:55 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 洗滌 洗滌 加酶作用底物，呈色孔為陽性克隆孔 ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選 三、篩選陽性克隆與克隆化 ? （ 2）克隆化 —— 有限稀釋法和軟瓊脂法 ? 篩選出來的陽性克隆中，可能含有不分泌抗體的細(xì)胞或有多株分泌抗體的細(xì)胞 ，而且剛剛?cè)诤汐@得的雜交瘤細(xì)胞不穩(wěn)定，染色體容易丟失，因此應(yīng)盡早克隆化。 ? 一般融合后獲得的 雜交瘤細(xì)胞要經(jīng)過大約 3次的克隆化，才能達到 100%孔內(nèi)均為抗體陽性細(xì)胞克隆。常用的克隆化方法有有限稀釋法和軟瓊脂法。 ? 有限稀釋法是把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每個孔中在理論上只含有一個細(xì)胞。第一次克隆化時也要應(yīng)用 HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可用不含 HT的 RPMI1640培養(yǎng)液。由于單個細(xì)胞難以存活，克隆化時也需加入飼養(yǎng)細(xì)胞輔助其生長。 三、篩選陽性克隆與克隆化 ? （ 2）克隆化 —— 有限稀釋法和軟瓊脂法 ? 軟瓊脂法是在培養(yǎng)液中加入 %左右的瓊脂糖凝膠，細(xì)胞分裂后形成小球樣團塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細(xì)吸管將小球吸出，團塊打碎后，移入 96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。用這種方法可以吸出大量克隆細(xì)胞進行培養(yǎng)，因初代細(xì)胞很不易增殖，所以用軟瓊脂法進行克隆化容易成功。 四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 ? （ 1）雜交瘤細(xì)胞的鑒定 ? 正常鼠的脾細(xì)胞染色體數(shù)為 40，全部是端著絲粒染色體。小鼠骨髓瘤細(xì)胞的染色體數(shù)變異較大， SP2/0細(xì)胞為 62~68， NS1細(xì)胞為 54~64，大多數(shù)為非整倍性，并且有中部著絲點染色體和亞中部著絲點染色體。雜交瘤細(xì)胞的染色體在數(shù)目上接近兩種親本細(xì)胞染色體數(shù)目的總和，在結(jié)構(gòu)上除多數(shù)為端著絲粒染色體外，還應(yīng)出現(xiàn)少數(shù)標(biāo)志染色體。 ? 染色體數(shù)目較多又比較集中的雜交瘤細(xì)胞能穩(wěn)定分泌高效價的抗體，而染色體數(shù)目少且比較分散的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力較低。 四、雜交瘤細(xì)胞與抗體性狀的鑒定 ? （ 2）抗體性狀的鑒定 ? 由于不同類和不同亞類的免疫球蛋白生物學(xué)特性差異較大，諸如補體活化、免疫調(diào)理、 ADCC效應(yīng)等等，因此要對制備的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體，進行 Ig類和亞類的鑒定，可用羊或兔抗Ig不同類和亞類的抗體，進行免疫擴散或 ELISA法來鑒定。在單克隆抗體鑒定中還必須進行親和力測定，它可為正確選擇不同用途的單克隆抗體提供依據(jù)。另外根據(jù)需要不同，還應(yīng)對單克隆抗體的特異性、純度和識別抗原的相對分子量等進行測定。 五、單克隆抗體的大量制備 ? （ 1）體外培養(yǎng)法可獲得 10?g/ml的抗體；（ 2）動物體內(nèi)誘生法，可獲得 5~20mg/ml的抗體。目前多采用后者生產(chǎn)制備單克隆抗體。因為雜交瘤細(xì)胞的兩種親本細(xì)胞均來自 BALB/c小鼠，所以應(yīng)選用 BALB/c小鼠來制備單克隆抗體。 ? 為了使雜交瘤細(xì)胞在腹腔內(nèi)增殖良好，可于注入細(xì)胞的幾周前，預(yù)先將具有刺激性的 有機溶劑降植烷（ pristane） 注入腹腔內(nèi)，以破壞腹腔內(nèi)膜，建立雜交瘤易于增殖的環(huán)境。動物體內(nèi)誘生法操作簡便，也比較經(jīng)濟，所得單克隆抗體量較多且效價亦高，還可有效地保存雜交瘤細(xì)胞株和分離已污染雜菌的雜交瘤細(xì)胞株，缺點是小鼠腹水中混有來自小鼠的多種雜蛋白，給純化帶來難度。 五、單克隆抗體的大量制備 ? 書中介紹了體外培養(yǎng)法和動物體內(nèi)誘生法的具體步驟以及其它一些近來發(fā)展的方法。這里不一一介紹。 ? 利用懸浮培養(yǎng)方式可增加細(xì)胞生長空間，雜交瘤細(xì)胞生長旺盛，單克隆抗體產(chǎn)量得到提高。連續(xù)懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞密度可達 ?107細(xì)胞 /ml， 收集的單克隆抗體可達到 400?g/ml左右。如在培養(yǎng)液中加入固體顆粒作為細(xì)胞生長的載體，增大單位體積的表面積，利于雜交瘤細(xì)胞生長，細(xì)胞密度可達 108細(xì)胞 /ml。 并能收獲更多的單抗。此稱為微載體懸浮培養(yǎng)法，固體顆粒用 DEAESephadex A 50等材料制成。 六、單克隆抗體的純化 ? 動物體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體具體方法及過程 ? 澄清和沉淀處理 ? 小鼠腹水中含有紅細(xì)胞、細(xì)胞碎塊、纖維蛋白凝塊及脂質(zhì)等，應(yīng)首先用離心力 1000g離心 5min，去除殘留的小顆粒物質(zhì)；再用 ?m的微孔濾膜過濾，除掉污染的細(xì)菌、支原體和脂質(zhì)；用飽和硫酸銨沉淀抗體， 50%飽和硫酸銨能回收 90%以上的單克隆抗體。 ? 分離 ? 根據(jù)用途可選用不同的方法，主要分離方法有凝膠過濾、陰離子交換層析、親和層析等。 六、單克隆抗體的純化 ? 分離 ? （ 1）凝膠過濾 用于 IgG和 IgM類單克隆抗體的分離純化。常用 Sephadex G200作分離介質(zhì)，可收集到三個峰，最高峰為 IgM， 另兩個峰為 IgG， 抗體回收率達50%~80%，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度可達95%以上。 ? （ 2）陰離子交換層析
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