【正文】 水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團(tuán)之間的相互作用，無機(jī)鹽的存在能使相互作用力增強。色譜技術(shù)是醫(yī)藥生物技術(shù)下游過程精制階段的常用手段，其優(yōu)點是該法具有多種多樣的分離機(jī)制、設(shè)備簡單、便于自動化控制和分離過程中無發(fā)熱等 有害效應(yīng)。 （ 2）物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。 分離純化的基本過程 若是論述題最好對過程進(jìn)行一定的介紹 建立分離純化工藝的根據(jù) P46 （ 1）含目的產(chǎn)物的起始料的特點 基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過程的各種因素對分離、純化工藝有影響。 （ 3）連續(xù)培養(yǎng) （ 4）透析培養(yǎng) （ 5）固定化培養(yǎng) 基因工程菌的培養(yǎng)工藝 P37 （ 1） 培養(yǎng)基的影響（ 2） 接種量的影響（ 3） 溫度的影響（ 4）溶氧量的影響（ 5）誘導(dǎo)時機(jī)的影響（ 6）誘導(dǎo)表達(dá)程序的影響： 一般在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期升溫誘導(dǎo)表達(dá)。適當(dāng)提高 pH，可減少乙酸的抑制作用 ； P31 第六節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性 質(zhì)粒不穩(wěn)定分為那兩類？ P32 工程菌在傳代過程中經(jīng)常出現(xiàn)質(zhì)粒不穩(wěn)定的現(xiàn)象，質(zhì)粒不穩(wěn)定分為 分裂不穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。 穿梭載體： 指含有兩個親緣關(guān)系不同的復(fù)制子，能在兩種不同的生物中復(fù)制的 載體（ 例如既能在原核生物中復(fù)制 ,又能在真核生物中復(fù)制的載體 ）。 ⑶ 分泌型表達(dá) 藥物基因（ 外源基因融合到編碼原核蛋白信號肽序列的下游） 優(yōu)點：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不 含蛋氨酸殘基； 缺點：產(chǎn)量不高， 信號肽不被切割。 真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式 P26 ⑴以 融合蛋白 的形式表達(dá)藥物基因 以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱融合蛋白。 ③ SD 序列和起始密碼 ATG 的間距 ：表達(dá)非融合蛋白的關(guān)鍵是原核 SD 序列和真核起始密碼ATG 之間的距離，距離過長過短都影響真核基因的表達(dá)。單個細(xì)胞產(chǎn)量取決于： （ 1）外源基因的劑量 ：一般來說細(xì)菌內(nèi)基因拷貝數(shù)增加，基因的表達(dá)產(chǎn)物也 增加。能外分泌，產(chǎn)物可糖基化。 ⑶鏈霉菌：作為外源性基因表達(dá)受到重視。其內(nèi)毒素很難除去。 P20 基因表達(dá)的微生物宿主細(xì)胞分為兩大類： P21 第一類為原核細(xì)胞（常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等）； ⑴大腸桿菌（目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系）：表達(dá)基因產(chǎn)物形式多樣，大腸桿菌中的表達(dá)不存在信號肽，產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難。 （ 5）從 cDNA 文庫中篩選目的基因 ：得到 cDNA 文庫后，通常采用核酸探針雜交法和免疫反應(yīng)鑒定法從數(shù)以萬計的 DNA 片段中篩選出目的基因。 （ 2）利用 反轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)制備基因 （ 3）化學(xué)合成法： 只適用于克隆小分子肽的基因 利用逆轉(zhuǎn)錄法獲得目的基因的基本過程 P16 （ 1） mRNA 的純化 ：從表達(dá)目的基因的細(xì)胞中提取總 RNA，用寡聚脫氧胸苷（ dT）纖維素柱從總 RNA 中提取純化 mRNA。 基因工程藥物制造的主要程序 （過程）（重點和后面幾節(jié)聯(lián)系起來） （ 1）目的基因的克隆 （分離目的基因）： 通過逆轉(zhuǎn)錄、 反轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、化學(xué)合成方法來制備 cDNA， 再通過核酸探針雜交或免疫反應(yīng)來篩選目的基因 （ 2）目的基因與載體連接構(gòu)建 DNA 重組體： 通過限制性內(nèi)切酶 DNA 連接酶等核酸酶，把目的基因組入載體的相關(guān)克隆位點，常用的載體有質(zhì)粒載體和 噬菌體載體 （ 3）將 DNA 重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌：常用的宿主菌有大腸桿菌、酵母菌等，先使宿主菌處于感受態(tài)，再通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式把重組 DNA 導(dǎo)入宿主菌，以構(gòu)建工程菌 （ 4）工程菌發(fā)酵： 提供適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、反應(yīng)器、控制好 發(fā)酵過程中的各種參數(shù)，如溫度、 PH、溶氧等，并通過升溫來誘導(dǎo)產(chǎn)物表達(dá) （ 5）目的基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化： 通過固液分離、初 步純化、高度純化、成品加工來制備產(chǎn)品；若是胞內(nèi)產(chǎn)物需要細(xì)胞破碎，若是包涵體則需要變性和復(fù)性 （ 6）產(chǎn)品的檢驗 ： 檢測產(chǎn)品的質(zhì)量和性能 。 P5 生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用有哪些？ P7 （ 1）基因工程制藥：① 開發(fā)基因工程藥物，如干擾素（ IFN）、紅細(xì)胞生成素（ EPO）等 ②基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗 ③基因工程抗體，它可以作為導(dǎo)向藥物的載體 ④基因診斷與基因治療⑤應(yīng)用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型 ⑥應(yīng)用極影工程激活素改良菌種，產(chǎn)生新的微生物藥物 ⑦改進(jìn)藥物生產(chǎn)工藝 ⑧利用轉(zhuǎn)基因動、植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物。 現(xiàn)代生物藥物分為 4 類 ：重組 DNA 技術(shù)制造的基因重組多肽、蛋白質(zhì)類治療劑；基因藥物；天然藥物；合成與部分合成藥物。 P1 蛋白質(zhì)工程 第二代基因工程；海洋生物技術(shù) 第三代生物技術(shù) P1 生物技術(shù)發(fā)展史：傳統(tǒng)、近代（抗生素、發(fā)酵罐）、現(xiàn)代（ DNA 重組） P3 1974 年， Boyer 和 Cohen 建立了 DNA 重組技術(shù) 1975 年， Koher 和 Milstein 建立了單克隆抗體技術(shù) 1982 年，第一個基因工程藥物重組人胰島素被批準(zhǔn)上市 1989 年， 我國 第一個基因工程藥物干擾素批準(zhǔn)上市 2020 年， 中國的重組腺病毒 p53 注射液成為石階上第一個正式批準(zhǔn)的基因治療藥物。生物技術(shù)制藥復(fù)習(xí)題 第一章 緒論 第一節(jié) 生物技術(shù)的發(fā)展史 生物技術(shù) ：以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，利用生物體的特性和功能，設(shè)計構(gòu)建具有與其性狀的新物種或新品系，并與工程結(jié)合，利用這樣的新物種進(jìn)行加工生產(chǎn)，為社會提供商品服務(wù)的一個綜合性技術(shù)體系。 第二節(jié) 生物技術(shù)藥物 生物技術(shù)制藥 ：生物技術(shù)制藥：采用現(xiàn)代生物技術(shù)人為地創(chuàng)造一些條件，借助某些微生物、植物或動物來生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品。 生物藥物按用途分為：治療藥物；預(yù)防藥物；診斷藥物。 （ 2）細(xì)胞工程制藥①單克隆抗體技術(shù) ②動物細(xì)胞培養(yǎng) ③植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次級代謝產(chǎn)物。 第三節(jié) 目的基因的獲得 利用基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽需要得到其基因，制備目的基因常用的方法有哪些？ P16 （ 1）逆轉(zhuǎn)錄法 以 mRNA 為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的到 cDNA，構(gòu)建 cDNA 文庫，從 cDNA 文庫中篩選目的基因。 （ 2） cDNA 的合成 ：以 mRNA 為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA 第一鏈，再用 DNA 聚合酶合成 cDNA 的雙鏈。 載體分為：表達(dá)型載體和非表達(dá)型載體。因分泌能力不足，真核蛋白質(zhì)常形成不溶性的包含體，表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)變性復(fù)性才恢復(fù)活性。 ⑵枯草芽胞桿菌：分泌能力強，蛋白質(zhì)不形成包含體。不致病、使用安全、分泌能力強、表達(dá)產(chǎn)物可糖基化。已有不少真核基因成功表達(dá) ⑵絲狀真菌：分泌能力強，能正確進(jìn)行翻譯后加工（肽剪切糖基化）有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。 （ 2）外源基因的表達(dá)效率 ① 啟動子的強弱： 啟動子是在轉(zhuǎn)錄水平上影響基因表達(dá)的因素。 ④ 密碼子組成：應(yīng)選擇使用大腸桿菌偏愛的密碼子。 優(yōu)點：操作簡便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，易實現(xiàn)高效表達(dá)； 缺點：只能作抗原用。 載體相關(guān)定義 載體： 在基因工程重組 DNA 技術(shù)中將 DNA 片段 (目的基因 )轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞的一種能自我復(fù)制的 DNA 分子。 載體的復(fù)制系列可分四類： P27 （ 1） Yep 類（酵母附加體質(zhì)粒）（ 2） YRp 類（酵母復(fù)制型質(zhì)粒） （ 3） YCp 類（酵母著絲粒質(zhì)粒）（ 4） YIp 類（酵母整合型質(zhì)粒） 影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素 ⑴外源基因的拷貝數(shù) ⑵外源基因的表達(dá)效率：①啟動子 ②分泌信號的效 率 ③終止序列的影響 ⑶外源蛋白的糖基化 ⑷宿主菌株的影響：①菌體生長力強 ②菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱 ③菌體性能穩(wěn)定 ④分泌能力強 1 精確表達(dá)載體 P28 酵母載體有兩類：普通表達(dá)載體和 精確表達(dá)載體 。 質(zhì)粒的分裂不穩(wěn)定 是指工程菌在分裂時出現(xiàn)一定比例的不含質(zhì)粒的子代菌的現(xiàn)象。 （ 7） pH 的影響：生長 pH在 ～ 左右，后期外源蛋白的表達(dá)其最佳 pH為 ～ 。包括：①菌種的類型及其代謝特性。 （ 3）目的產(chǎn)物特性。色譜技術(shù)分為離子 交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜、高 壓液相色譜等。流動相為 pH6～ 8 鹽水溶液。 （ 4） 凝膠過濾層析 P59 凝膠過濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動，大分子量物質(zhì)先流出，小分子物質(zhì)后流出。 (3)收率要高。 包涵體的分離和溶解 P63 （ 1）包涵體的分離：重組菌破碎后，離心得沉淀部分，再用低濃度變性劑（ 脲或鹽酸胍）、去垢劑（ Triton X100）、脫氧膽酸鈉洗滌。 （ 2）氨基酸成分分析 在氨基酸成分分析中，一般含 50 個左右的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的定量分析是接近理論值的，即與序列分析結(jié)果一致。 （ 5）蛋白質(zhì)二硫鍵分析 二硫鍵和巰基與蛋白質(zhì)的生物活性密切相關(guān)，基因工程藥物產(chǎn)品的硫 硫鍵是否正確配對 是一個重要問題。兩種形態(tài)： 成纖維細(xì)胞型和上皮細(xì)胞型 （ 2）懸浮細(xì)胞： 生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。 什么是接觸抑制現(xiàn)象？ P84 當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時，即每個細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞相互接觸時， 細(xì)胞就停止增殖。 動物細(xì)胞的生理特點 P83 （ 1）細(xì)胞的分裂周期長 動物細(xì)胞分裂所需的時間一般為 12～ 48h，它不僅隨細(xì)胞種屬的不同而不同，就是同一種屬的，不同部位的細(xì)胞其所需的時間也不同。 (6)動物細(xì)胞對蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不 同 動物細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成除了在游離的核糖體上進(jìn)行外，還在與糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上結(jié)合的核糖 體上進(jìn)行。 (1)原代細(xì)胞 原代細(xì)胞是直接取自動物組織、器官，經(jīng)過分碎，消化而獲得的細(xì)胞懸液。 (3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞 這類細(xì)胞是通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，它常常由于染 色體的斷裂變成了異倍體，從而失去了“正?！奔?xì)胞的特點，而獲得了無限增殖的能力。 C； (6)空氣 :氧的飽和質(zhì) 60%,氧分壓 4～ 培養(yǎng)動物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類和組成 P95 動物細(xì)胞培養(yǎng)基大致可以分成三類： 天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基。④ 細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。 傳代方法： （ 1）懸浮細(xì)胞：加生長液，然后分種 （ 2） 貼壁生長細(xì)胞傳代 ： 采用酶消化法傳代。 （目前在生產(chǎn)中用于懸浮培養(yǎng)的設(shè)備主要是通氣攪拌罐式生物反應(yīng)器和氣升式生物反應(yīng)器。 3．貼壁 — 懸浮培養(yǎng) ① 微載體培養(yǎng)：可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積供細(xì)胞貼附生長增殖，載體的體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。該培養(yǎng)方法操作簡便，節(jié)省了微載體的成本。另一種是先將細(xì)胞和培養(yǎng)基加入反應(yīng)器，待細(xì)胞生長至一定密度后，往反應(yīng)器內(nèi)加入誘導(dǎo)劑或病毒等，經(jīng)一段時間作用后，將反應(yīng)物取出。它與連續(xù)式操作不同處，在于取出部分 條件培養(yǎng)基時，絕大部分細(xì)胞仍保留在反應(yīng)器內(nèi)，而連續(xù)式培養(yǎng)則同時也取出部分細(xì)胞。設(shè)備成本盡可能低。 P137 第四章 抗體制藥 第一節(jié) 概述 P143 抗體：即 Ig，指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。 P144 第二節(jié) 單克隆抗體及其制備 （重點） 克隆化：指單個細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個培養(yǎng)過程。體內(nèi)免疫就是將抗原注射到小鼠腹腔，使小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)， B 細(xì)胞迅速增殖；體外免疫小鼠脾細(xì)胞的懸浮液與抗原一起培養(yǎng)后，再分離脾細(xì)胞。 次黃嘌呤 (H)氨甲喋呤 (A)胸腺嘧啶 (T)配制。 ）和 軟瓊脂法 （ 將雜交瘤細(xì)胞稀釋到一定密度，然后與瓊脂混懸。 （ 6）單克隆抗體的純化 依單抗 IgG 類和亞類不同，選各種不同的純化方法。 原理： 酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合，此種結(jié)合不會改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。 P147 第三節(jié) 基因工程 抗體及其制備 （即鼠源性單克隆抗體的改造） 基因工程抗體： 過 PCR 技術(shù)獲得抗體基因或抗體基因片段，與適當(dāng)載體重組后引入不同表達(dá)系統(tǒng)所產(chǎn)生的抗體，被廣泛應(yīng)用于疾病的臨床臨床診斷、預(yù)防、治療及基礎(chǔ)理論研究等領(lǐng)域。 基因工程抗體及其特性和制備方法 （ P152 圖 44） （ 1） 人鼠嵌合抗體 ：在基因水平上將鼠源單抗的 H 和 L 鏈可變區(qū)（ V 區(qū)）基因分離出來，分別與人 Ig 的 H 和 L 鏈的穩(wěn)定區(qū)（ C）基因連接成人 鼠嵌合抗體的 H 和 L 鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表達(dá)完整人 鼠嵌合抗體。 Fab 抗體只有完整 IgG 的 1/3。 VH或 VL （ 7）最小識別單位：即 MRU，只含有 一個 CDR 多肽的抗體，也為超變區(qū)多肽。 P158 第五節(jié) 抗體工程 抗體工程 ： 指利用重組 DNA 和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對抗體基因進(jìn)行加工改造和重新裝配，經(jīng)轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞后，表達(dá)抗體分子，或用細(xì)胞融合、化學(xué)修飾等方法改造抗體分子的工程。通過 “ 吸附－洗脫－擴(kuò)增 ” 的富集過程 ， 從中篩選出特異性抗體的可變區(qū)基因。 （ 1）熒光抗體診斷試劑：熒光抗體是用熒光色素 ,如異硫氰酸熒光素（ FITC）、羅丹明（ RB200）、藻紅素（ PE）等標(biāo)記抗體蛋白，即成熒光抗體。 常 用的標(biāo)