【正文】 P43 ①發(fā)酵條件的改進(jìn) （普遍采用 6g/L 的甘油為碳源）； ； 力 ②構(gòu)建出產(chǎn)乙酸能力低的工程化宿主菌 ； ； ； ③構(gòu)建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌 第十節(jié) 基因工程藥物的分離純化 表達(dá)的產(chǎn)物都是多肽或蛋白質(zhì) ，它的制得具有以下特點(diǎn)： P46 （ 1）表達(dá)產(chǎn)物在初始料中含量較低；（ 2）含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物；（ 3）表達(dá)產(chǎn) 物穩(wěn)定性差，易失活變性；（ 4）表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多、結(jié)構(gòu)不一、活性各異；（ 5）對(duì)其質(zhì)量要求純度高、無(wú)菌、無(wú)熱原。 分離純化的基本過(guò)程 若是論述題最好對(duì)過(guò)程進(jìn)行一定的介紹 建立分離純化工藝的根據(jù) P46 （ 1）含目的產(chǎn)物的起始料的特點(diǎn) 基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過(guò)程的各種因素對(duì)分離、純化工藝有影響。包括：①菌種的類型及其代謝特性。②原材料培養(yǎng)基的來(lái)源及其質(zhì)量。③生產(chǎn)工藝及條件。 （ 2）物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì)。 （ 3）目的產(chǎn)物特性。 （ 4）產(chǎn)品質(zhì)量的要求 細(xì)胞破碎與固液分離 ⑴細(xì)胞收集： 離心法 、膜分離法。 ⑵細(xì)胞破碎：機(jī)械破碎法、非機(jī)械破碎法；物理法、化學(xué)法、生物法 ⑶固液分離：離心、膜過(guò)濾、雙水相萃取 細(xì)胞破碎的方法； P47 （ 1）物理方法：勻漿法、珠磨法、超聲波法 （ 2）化學(xué)法：滲透沖擊法（高滲 +低滲）、增溶法（表面活性劑等） （ 3）生物法：酶溶法 分離純化常用的色譜分離方法有那些？ P50 分離純化主要依賴色譜分離方法。色譜技術(shù)是醫(yī)藥生物技術(shù)下游過(guò)程精制階段的常用手段，其優(yōu)點(diǎn)是該法具有多種多樣的分離機(jī)制、設(shè)備簡(jiǎn)單、便于自動(dòng)化控制和分離過(guò)程中無(wú)發(fā)熱等 有害效應(yīng)。色譜技術(shù)分為離子 交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過(guò)濾色譜、高 壓液相色譜等。 （ 1）離子交換層析 P51 離子交換介質(zhì)由三部分構(gòu)成：（ 1）不溶性高分子聚合物 — 載體；（ 2）共價(jià)鍵結(jié)合于載體上 活性基團(tuán)或功能集團(tuán)（ 3）與活性基團(tuán)帶相反電荷 平衡離子或反離子（決定是陰離子交換樹(shù)脂還是陽(yáng)離子交換樹(shù)脂）如：酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 RSO3H 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和表面電荷的分布主要影響離子交換的性能。 它由平衡、上樣、洗脫（分為梯度洗脫和階段洗脫 2 種）、再生 4 個(gè)主要步驟構(gòu)成。 （ 2）疏水層析 P54 利用蛋白質(zhì)分子表面上的疏 水區(qū)域和介質(zhì)中的疏水基團(tuán)之間的相互作用，無(wú)機(jī)鹽的存在能使相互作用力增強(qiáng)。流動(dòng)相為 pH6～ 8 鹽水溶液。常用的介質(zhì)是多聚糖（如瓊脂糖）和硅膠。 （ 3）親和層析 P4756 親和層析是利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附，如抗體與抗原、受體與激素、酶與底物之間的作用。洗脫時(shí)分為特異性洗脫和非特異性洗脫。 （ 4） 凝膠過(guò)濾層析 P59 凝膠過(guò)濾是以具有大小一定的多孔性凝膠作為分離介質(zhì)，小分子能進(jìn)入孔內(nèi)，在柱中緩慢移動(dòng)，而大分子不能進(jìn)入孔內(nèi)，快速移動(dòng)，大分子量物質(zhì)先流出，小分子物質(zhì)后流出。利用這種移動(dòng)差別 可使大分子與小分子分開(kāi)。 用于分離純化的技術(shù)應(yīng)滿足那些要求？ P62 (1)技術(shù)條件溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性。 (2)選擇性好，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來(lái)，達(dá)到較高純化倍數(shù)。 (3)收率要高。 (4)兩個(gè)技術(shù)之間不需要對(duì)物料加以處理或調(diào)整，這樣可以減少工藝步驟。 (5)整個(gè)分離純化過(guò)程要快速，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。 第十一節(jié) 變性蛋白的復(fù)性 外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)常常導(dǎo)致包涵體的形成 P63 包涵體：指細(xì)菌表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無(wú)活性的固體顆粒。 包涵體的分離和溶解 P63 （ 1）包涵體的分離：重組菌破碎后，離心得沉淀部分，再用低濃度變性劑（ 脲或鹽酸胍）、去垢劑（ Triton X100）、脫氧膽酸鈉洗滌。 （ 2）包涵體溶解：般用強(qiáng)的變性劑如脲（ 68M）、鹽酸胍（ 6M），或用去垢劑，如 SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等，溶解涵體蛋白質(zhì)。 （ 3）包涵體復(fù)性：稀釋復(fù)性和透析復(fù)性；含二硫鍵的蛋白的復(fù)性；封閉蛋白的疏水蔟促進(jìn)復(fù)性；凝膠過(guò)濾層析復(fù)性；小分子添加劑促進(jìn)的復(fù)性；分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性；人工分子伴侶的復(fù)性 第十二節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控 制 由基因重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品進(jìn)行鑒定時(shí)，常作那些項(xiàng)目分析？ P68 （ 1）肽圖分析 肽圖分析是用酶法或化學(xué)法降解目的蛋白質(zhì)后，對(duì)生成的肽段進(jìn)行的分離分析。它是一種可檢測(cè)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中細(xì)微變化的最有效方法，該技術(shù)靈敏高效的特點(diǎn)使其成為對(duì)基因工程 藥物的分子結(jié)構(gòu)和遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證的首選方法。 （ 2）氨基酸成分分析 在氨基酸成分分析中，一般含 50 個(gè)左右的氨基酸殘基的蛋白質(zhì)的定量分析是接近理論值的，即與序列分析結(jié)果一致。 （ 3）部分氨基酸序列分析 部分氨基酸序列分析（ N 端 15 個(gè)氨基 酸）可作為重組蛋白質(zhì)和多肽的重要鑒定指標(biāo)。 （ 4）重組蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定和分子量測(cè)定 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法主要有凱氏定氮法、雙縮脲法、染料結(jié)合比色法、福林 酚法和紫外法等。蛋白質(zhì)分子量測(cè)定最常用的方法有凝膠過(guò)濾法和 SDSPAGE 法，凝膠過(guò)濾法是測(cè)定完整的蛋白質(zhì)分子量，而 SDSPAGE 法測(cè)定的是蛋白質(zhì)亞基的分子量。 （ 5）蛋白質(zhì)二硫鍵分析 二硫鍵和巰基與蛋白質(zhì)的生物活性密切相關(guān)，基因工程藥物產(chǎn)品的硫 硫鍵是否正確配對(duì) 是一個(gè)重要問(wèn)題。 第三章 動(dòng)物細(xì)胞制藥 第一節(jié) 概述 細(xì)胞工程： 是指以細(xì)胞為對(duì)象，應(yīng)用 生命科學(xué)理論，借助工程學(xué)原理與技術(shù)，有目的地利用或改造生物遺傳特性，以獲得特定的細(xì)胞、組織產(chǎn)品或新型物種的一門(mén)綜合性科學(xué)技術(shù)。 P79 第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn) （重點(diǎn)） 離體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞分為那些類型？ P81 動(dòng)物細(xì)胞適應(yīng)功能 ,形態(tài)各異。離體培養(yǎng)細(xì)胞分兩類：貼壁細(xì)胞；懸浮細(xì)胞 （ 1）貼壁細(xì)胞 生長(zhǎng)須有貼附的支持物表面， 自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼 附因子才能在該表面上生長(zhǎng)。兩種形態(tài)： 成纖維細(xì)胞型和上皮細(xì)胞型 （ 2）懸浮細(xì)胞： 生長(zhǎng)不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)。如淋巴細(xì)胞。 （ 3）兼性貼壁細(xì)胞：生長(zhǎng)不嚴(yán)格依賴支持物。如中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠 L929 細(xì)胞。 什么是接觸抑制現(xiàn)象？ P84 當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片時(shí)，即每個(gè)細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞相互接觸時(shí)， 細(xì)胞就停止增殖。此時(shí)若能保持充足的營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞仍可存活相當(dāng)一段時(shí)間，但細(xì)胞密度不再 增加，所以該現(xiàn)象又稱之謂接觸抑制或密度依賴抑制現(xiàn)象。一旦細(xì)胞轉(zhuǎn)化為異倍體后，該現(xiàn) 象隨之消失，細(xì)胞可多層生長(zhǎng)。細(xì)胞密度也就可大大增加。 動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn) P83 （ 1）細(xì)胞的分裂周期長(zhǎng) 動(dòng)物細(xì)胞分裂所需的時(shí)間一般為 12～ 48h，它不僅隨細(xì)胞種屬的不同而不同，就是同一種屬的，不同部位的細(xì)胞其所需的時(shí)間也不同。 周期 =間期 +分裂期 間期（ G1+S+G2） 分裂期（ M） （ 2）細(xì)胞生長(zhǎng)需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象 (3)正常二倍體細(xì)胞的生長(zhǎng)壽命是有限的 (4)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周圍環(huán)境十分敏感。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)各種物理化學(xué)因素，如滲透壓， pH，離子濃度，剪切力，微量元素等的變化耐受力很弱。 (5)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高 氨基酸、維生素，多種無(wú)機(jī)鹽和微量元素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子。 (6)動(dòng)物細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不 同 動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成除了在游離的核糖體上進(jìn)行外，還在與糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上結(jié)合的核糖 體上進(jìn)行。（ 游離核糖體合成蛋白質(zhì)用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體合成蛋白質(zhì)是分泌的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。） 動(dòng)物細(xì)胞作為宿主細(xì)胞生產(chǎn)藥物的特點(diǎn)； P85 （ 1）優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)品多分泌在胞外，收集純化方便，得到較完善的翻譯后修飾，特別是糖基化，因此與天然產(chǎn)品更一致，適于臨床 （ 2）缺點(diǎn)：培養(yǎng)條件要求高，成本貴，產(chǎn)量低 第三節(jié)生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的要求和獲得 生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞的種類及其特點(diǎn) P86 用于生產(chǎn)的動(dòng)物細(xì)胞有三類， 即 原代細(xì)胞 、已建立的 二倍體細(xì)胞系 、以及可無(wú)限期傳代 的 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系 ，以及用這些細(xì)胞進(jìn)行 融合 和 重組的工程細(xì)胞 。 (1)原代細(xì)胞 原代細(xì)胞是直接取自動(dòng)物組織、器官，經(jīng)過(guò)分碎，消化而獲得的細(xì)胞懸液。用得最多的是雞胚細(xì)胞，原代兔腎或鼠腎細(xì)胞，以及血液的淋巴細(xì)胞。 (2)二倍體細(xì)胞系 原代細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代、篩選、克隆，從而從多種細(xì)胞成分的組織中挑選，并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。該細(xì)胞株仍具備“正?！奔?xì)胞的特點(diǎn)，一般均從動(dòng)物的胚胎組織中獲取。 (3)轉(zhuǎn)化細(xì)胞 這類細(xì)胞是通過(guò)某個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程形成的，它常常由于染 色體的斷裂變成了異倍體，從而失去了“正?！奔?xì)胞的特點(diǎn)，而獲得了無(wú)限增殖的能力。由于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞具有無(wú)限生命力，而且常常倍增時(shí)間較短，對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子等要求較低，故更適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。 (4)其他：融合細(xì)胞系（物理法如高壓電場(chǎng)和化學(xué)法如仙臺(tái)病毒、聚乙二醇）和重組工程細(xì)胞系 真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建，使用的載體有兩類：（ 1）病毒載體：牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒；（ 2）質(zhì)粒載體：穿梭質(zhì)粒載體 P88 重組 DNA 導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的常用方法：融合法、化學(xué)法、物理法、病毒法，最常用 磷酸鈣沉 淀法、 電穿孔法 P89 生產(chǎn)用的工程細(xì)胞必須建立兩個(gè)細(xì)胞庫(kù)：原始細(xì)胞庫(kù)（ MCB）、生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)（ MWCB）或工作細(xì)胞庫(kù)（ WCB） P91 第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基 動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件 P92 (1)器材的清洗和消毒 ①器材的清洗 :浸泡、刷洗、泡酸、沖洗 ②器材的消毒滅菌 : 物理消毒 /化學(xué)消毒 (2)水質(zhì) :電阻值大于 18MΩ ,去熱原。 (3) pH:～ (4)滲透壓 :290～ 300mOsm/kg (5)溫度 :哺乳動(dòng)物 37177。 C； (6)空氣 :氧的飽和質(zhì) 60%,氧分壓 4～ 培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基的種類和組成 P95 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基大致可以分成三類： 天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基。 （ 1）天然培養(yǎng)基：血清、羊水、腹水等 ,成分復(fù)雜、成分不穩(wěn)定 （ 2）合成培養(yǎng)基：成分明確、大量供應(yīng)， DME、 MEM、 DMEM 等（第一個(gè)合成培養(yǎng)基是 199 培養(yǎng)基；①氨基酸： 12 種必需氨基酸 +谷氨酰胺②維生素：形成輔基和輔酶③糖類：能源，用葡萄糖和谷氨酰胺④無(wú)機(jī)鹽：維持滲透壓⑤其它成分：核酸前體和氧化還原劑如谷胱甘肽⑥添加 5%～ 10%小牛血清：作用是提供生長(zhǎng)因子和激素；提供貼附 因子和伸展因子；提供結(jié)合蛋白；提供必需脂肪酸和微量元素 （ 3） 無(wú)血清培養(yǎng)基： 無(wú)血清培基的優(yōu)點(diǎn)如下：① 提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了由于血清批間差異的影響。 ② 減少了由血清帶來(lái)病毒、霉菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)。③ 供應(yīng)充足，穩(wěn)定。④ 細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。⑤ 避免了血清中某些因素對(duì)有些細(xì)胞的毒性。⑥ 減少了血清中蛋白對(duì)某些生物測(cè)定的干擾，便于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。（簡(jiǎn)答題時(shí)候可以不寫(xiě)優(yōu)點(diǎn)） 無(wú)血清培養(yǎng)基加入添加劑：生長(zhǎng)因子和激素（胰島素）；結(jié)合蛋白（鉄傳遞蛋白和白蛋白）；貼附因子和伸展因子（膠原等）； 有利細(xì)胞生長(zhǎng)的因子和元素（谷胱甘肽） 第五節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法 細(xì)胞傳代； P101 原代培養(yǎng)形成的單層細(xì)胞匯合以后，需要進(jìn)行分離培養(yǎng)，否則細(xì)胞會(huì)因生成空間不足或由于細(xì)胞密度過(guò)大引起營(yíng)養(yǎng)枯竭，都將影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，這一程序常稱為傳代或傳代培養(yǎng) 。 傳代方法： （ 1）懸浮細(xì)胞：加生長(zhǎng)液，然后分種 （ 2） 貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 ： 采用酶消化法傳代。常用的 消化液 有 ％的 胰蛋白酶 液。 第六節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)方法和操作方式 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法 P103 （ 1）懸浮培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)即讓細(xì)胞自由地懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)增殖。優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，不但細(xì)胞體積較小，較難采用灌流培養(yǎng)，因此細(xì)胞密度一般較低。 （目前在生產(chǎn)中用于懸浮培養(yǎng)的設(shè)備主要是通氣攪拌罐式生物反應(yīng)器和氣升式生物反應(yīng)器。） 2．貼壁培養(yǎng) 貼壁培養(yǎng) 是必須讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上，細(xì)胞才能生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)方法。較容易采用灌流 培養(yǎng)的方式使細(xì)胞達(dá)到高密度。但操作比較麻煩，需要合適的貼附材料和足夠的面積，培養(yǎng)條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差。 3．貼壁 — 懸浮培養(yǎng) ① 微載體培養(yǎng)：可創(chuàng)造相當(dāng)大的貼附面積供細(xì)胞貼附生長(zhǎng)增殖，載體的體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞自由地懸浮在培養(yǎng)基內(nèi)。 ② 包埋和微囊培養(yǎng)：包埋和微囊培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞不是貼附在載體表面，而是被包埋或包裹在凝膠載體或微囊內(nèi)。 包埋或包裹在載體或微囊內(nèi)的細(xì)胞可獲得保護(hù)，避免了剪切力的損害；可以 獲得較高的細(xì)胞密度；可采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。 （目前最普遍的是瓊脂糖和海藻酸鈣凝膠） ③ 結(jié)團(tuán)培養(yǎng) ：結(jié)團(tuán)培養(yǎng)的實(shí)質(zhì)是用細(xì)胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮的方法進(jìn)行培養(yǎng)，所以它也是一種貼附 — 懸浮培養(yǎng)。該培養(yǎng)方法操作簡(jiǎn)便，節(jié)省了微載體的成本