【正文】 串聯(lián)重復(fù)區(qū)DNA形成開環(huán)結(jié)構(gòu)；c. DnaB蛋白在DnaC的幫助下與未解鏈序列結(jié)合。每六個(gè)DnaB蛋白形成一組并與一條DNA母鏈結(jié)合，可在不同方向同時(shí)起始DNA的復(fù)制。當(dāng)細(xì)胞中存在足夠的SSB和DNA gyrase時(shí)，DnaB的解鏈效率非常高。整個(gè)DNA復(fù)制過(guò)程中，只有復(fù)制起始受細(xì)胞周期的嚴(yán)格調(diào)控。Once in each cell cycle。DNA甲基化與DNA復(fù)制起始密切相關(guān)。OriC中有11個(gè)GATC回文結(jié)構(gòu)（一般說(shuō)來(lái)，256bp才應(yīng)有一個(gè)GATC重復(fù)）。DNA子鏈被合成后，母鏈立即被甲基化（稱為hemimethylated）。此時(shí)，oriC與細(xì)胞原生質(zhì)膜相結(jié)合。只有當(dāng)oriC被從膜上釋放出來(lái)，子鏈被Dam甲基化后，才能有效地與DnaA蛋白結(jié)合，起始新一輪的DNA復(fù)制。復(fù)制起始可能還受ATP水解過(guò)程調(diào)控，因?yàn)镈naA只有與ATP相結(jié)合時(shí)才能與oriC區(qū)DNA相結(jié)合。2. DNA子鏈的延伸主要包括兩個(gè)不同但相互有聯(lián)系的事件，即前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。由DNA helicase解開雙螺旋，由拓樸異構(gòu)酶消除DNA鏈上的扭曲力，SSB結(jié)合使DNA單鏈穩(wěn)定。前導(dǎo)鏈的合成：由DnaG（primase）在復(fù)制起始位點(diǎn)附近合成一個(gè)1060 nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到該引物上。滯后鏈的合成：產(chǎn)生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I補(bǔ)上這一小段DNA序列，由DNA Ligase把兩個(gè)片段相連。3. DNA鏈的終止當(dāng)子鏈延伸達(dá)到terminus region（ter，帶有多個(gè)20bp序列）時(shí)，DNA復(fù)制就終止了。Ter有點(diǎn)像一個(gè)陷井（trap），使復(fù)制叉只能進(jìn)入，不能出來(lái)。Ter的功能主要是由TerTus復(fù)合物（ter utilization substance）來(lái)完成的。4. 真核細(xì)胞DNA的復(fù)制比大腸桿菌更復(fù)雜真核生物的origin of replication被稱為ARSautonomously replicating sequences或者被稱為replicators。Yeast replicators長(zhǎng)約150dp，有多個(gè)保守重復(fù)區(qū)，共有約500個(gè)replicators分布于酵母的17條染色體中。㈡、DNA的損傷修復(fù)1． 錯(cuò)配修復(fù)（mismatch Repair）錯(cuò)配修復(fù)對(duì)DNA復(fù)制忠實(shí)性的貢獻(xiàn)力達(dá)102103，DNA子鏈中的錯(cuò)配幾乎完全都被修正，充分反映了母鏈的重要性。2. 堿基切除修復(fù)（BaseExcision Repair）DNA gylcosylases能特異性識(shí)別常見(jiàn)的DNA損傷（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨?；a(chǎn)物）并將受損害堿基切除。去掉堿基后的核苷酸被稱為AP位點(diǎn)（apurinic or apyrimidinic）。細(xì)胞中最常見(jiàn)的Uracil Glycosylase就能特異性切除細(xì)胞中的去氨基胞嘧啶。3. 核苷酸切除修復(fù)（nucleotideexcision repair）當(dāng)DNA鏈上相應(yīng)位置的核苷酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無(wú)法形成氫鍵，由核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)負(fù)責(zé)進(jìn)行修復(fù)。（Direct repair） ㈢、DNA的轉(zhuǎn)座DNA的轉(zhuǎn)座，或稱移位（transposition），是由可移位因子（transposable element）介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座這一命名并不十分準(zhǔn)確，因?yàn)樵谵D(zhuǎn)座過(guò)程中，可移位因子的一個(gè)拷貝常常留在原來(lái)位置上，在新位點(diǎn)上出現(xiàn)的僅僅是拷貝。因此，轉(zhuǎn)座有別于同源重組，它依賴于DNA的復(fù)制。1． 轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征a. 簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位。最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子不含有任何宿主基因而常被稱為插入序列（insertion sequence，IS），它們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞常帶有少于10個(gè)IS序列。轉(zhuǎn)座子常常被定位到特定的基因中，造成該基因突變。IS序列都是可以獨(dú)立存在的單元，帶有介導(dǎo)自身移動(dòng)的蛋白。（posite transposon）是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是兩個(gè)相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某個(gè)功能基因兩端時(shí)就可能產(chǎn)生復(fù)合轉(zhuǎn)座子。一旦形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子，IS序列就不能再單獨(dú)移動(dòng)，因?yàn)樗鼈兊墓δ鼙恍揎椓耍荒茏鳛閺?fù)合體移動(dòng)。轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制轉(zhuǎn)座時(shí)發(fā)生的插入作用有一個(gè)普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的（312bp）、被稱為靶序列的DNA會(huì)被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個(gè)重復(fù)的靶序列之間。不同轉(zhuǎn)座子的靶序列長(zhǎng)度不同，但對(duì)于一個(gè)特定的轉(zhuǎn)座子來(lái)說(shuō)，它所復(fù)制的靶序列長(zhǎng)度都是一樣的，如IS1兩翼總有9個(gè)堿基對(duì)的靶序列，而Tn3兩端總有5bp的靶序列。轉(zhuǎn)座可被分為復(fù)制性和非復(fù)制性兩大類。在復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，所移動(dòng)和轉(zhuǎn)位的是原轉(zhuǎn)座子的拷貝。轉(zhuǎn)座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子。TnA類轉(zhuǎn)座主要是這種形式。在非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，原始轉(zhuǎn)座子作為一個(gè)可移動(dòng)的實(shí)體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座。① 轉(zhuǎn)座引起插入突變。② 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因。③ 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變。④ 轉(zhuǎn)座引起的生物進(jìn)化.六、RNA代謝除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都來(lái)自于DNA。基因組DNA通過(guò)一個(gè)被稱為轉(zhuǎn)錄的過(guò)程把貯存在雙鏈DNA分子中的遺傳信息轉(zhuǎn)換到與模板DNA鏈相互補(bǔ)的RNA單鏈上。mRNA，編碼了一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)序列；tRNA，把mRNA上的遺傳信息變?yōu)槎嚯闹械陌被嵝畔?；rRNA，是合成蛋白質(zhì)的工廠核糖體中的主要成份。 1． 依賴于DNA的RNA合成從DNA合成反應(yīng)的化學(xué)本質(zhì)、極性和模板的使用這三方面來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)錄與復(fù)制是相同的。但是，也存在三個(gè)主要不同點(diǎn)：A． 轉(zhuǎn)錄中不需要RNA引物；B．轉(zhuǎn)錄反應(yīng)一般只用一小段DNA做模板；C．在轉(zhuǎn)錄區(qū)，一般都只有一條DNA鏈可以作為模板。 一旦RNA聚合酶啟動(dòng)了基因轉(zhuǎn)錄，它就會(huì)沿著模板539?！?39。方向不停地移動(dòng)，合成RNA鏈，直到遇到終止信號(hào)時(shí)才釋放新生的RNA鏈，并與模板DNA脫離。研究RNA鏈終止時(shí)遇到最常見(jiàn)的問(wèn)題是339。端核苷酸的定位，因?yàn)榛罴?xì)胞內(nèi)部根據(jù)終止信號(hào)正確終止的RNA與一個(gè)經(jīng)過(guò)剪接的RNA在339。端沒(méi)有兩樣，都是OH基團(tuán)。模板DNA上都有終止轉(zhuǎn)錄的特殊信號(hào)終止子，每個(gè)基因或操縱子都有一個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)終止子。在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNADNA雜合鏈539。端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的339。端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rUdA區(qū)域。 a. 依賴于ρ因子的終止105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷三磷酸，實(shí)際上是一種NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來(lái)，從而終止轉(zhuǎn)錄。有人認(rèn)為，在RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的能量，沿著539?！?39。方向朝RNA聚合酶移動(dòng)，到達(dá)RNA的339。OH端后取代了暫停在終止位點(diǎn)上的RNA聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉(zhuǎn)錄過(guò)程。終止過(guò)程需要消耗能量，所以，ρ因子具有終止轉(zhuǎn)錄和核苷三磷酸酶兩種功能。 b、不依賴于ρ 因子的終止若終止點(diǎn)上游存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)；在終止點(diǎn)前面有一段由48個(gè)A組成的序列，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3‘端為寡聚U。這兩種結(jié)構(gòu)特征的存在同樣決定了轉(zhuǎn)錄的終止。 在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNADNA雜合鏈539。端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的339。端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rUdA區(qū)域。 TFⅡH還參與DNA的損傷修復(fù)。當(dāng)RNA polⅡ轉(zhuǎn)錄過(guò)程中碰到受損傷的核苷酸時(shí)，TFⅡH能及時(shí)啟動(dòng)核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)，將損傷修復(fù)。 Actinomycin D和Acridine阻斷RNA鏈的延伸 所以，RNA加工成熟主要包括：5’加帽子結(jié)構(gòu)；3’加多聚A；切除內(nèi)含子 。在Group I內(nèi)含子切除體系中，鳥苷或鳥苷酸的339。OH 作為親核基團(tuán)向Intron 539。的磷酸二酯鍵發(fā)起進(jìn)攻。Group II內(nèi)含子切除體系核內(nèi)mRNA原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪輯方式可能是最常見(jiàn)的。在這一模式中，RNA的剪輯需要特異性RNAprotein復(fù)合物small nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和small nuclear RNAs（snRNAs）。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有5種snRNAsU1，U2，U4，U5，U6。 第五講 分子生物學(xué)研究法一、 重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題； 保留復(fù)制機(jī)制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題；，相繼提出了中心法則和操縱子學(xué)說(shuō),成功地破譯了遺傳密碼，充分認(rèn)識(shí)了遺傳信息的流動(dòng)和表達(dá)。年份 事 件 1869 F Miescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。 1944 . Avery證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)。 1952 . 。 1953 。 1957 。 1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。 19591960 S. Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F. Jacob和J. Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。 1964 C. Yanofsky和S. Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。 1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測(cè)定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由質(zhì)粒DNA所決定。 1966 ，、。 1970 。 19721973 ，于72年獲得第一個(gè)重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。 19751977 、。1977年完成了全長(zhǎng)5387bp的噬菌體φ174基因組測(cè)定。 1978 首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。 1980 美國(guó)聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。 1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。 1982 美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測(cè)定。 1983 獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。 1984 斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。 1986 GMO首次在環(huán)境中釋放。 1988 J. D. Watson出任人類基因組計(jì)劃首席科學(xué)家。 1989 DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小氧Onouse。 1992 歐共體35個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測(cè)定(315kb) 1994 第一批基因工程西紅柿在美國(guó)上市。 1996 完成了酵母基因組(107bp)全序列測(cè)定。 1997 英國(guó)愛(ài)丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。 基因工程中常見(jiàn)的名詞:遺傳工程genetic engineering，基因操作gone manipulation，基因克隆gone cloning，重組DNA技術(shù)rebinant DNA technology，分子克隆molecular cloning?；蚬こ痰闹饕獌?nèi)容或步驟:1. 從生物有機(jī)體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2. 將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。3. 將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）并與之一起增殖。4. 從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞，并篩選出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因。5. 將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。二、 基因操作的主要技術(shù)原理1． 核酸的凝膠電泳(Agarose amp。amp。 Polyacrylamide)將某種分子放到特定的電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動(dòng)。某物質(zhì)在電場(chǎng)作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。在生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)是離子化的，所以，DNA和RNA實(shí)際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場(chǎng)中，它就會(huì)由負(fù)極→正極移動(dòng)。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）ethidium bromide染色，此時(shí)，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ng DNA所形成的條帶。DNA的脈沖電泳技術(shù) :PFGEPulsefield gel electrophoresis2． 核酸的分子雜交技術(shù)在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過(guò)凝膠電泳 分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過(guò)毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動(dòng)地吸印 轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）等。核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)包括如下兩個(gè)步驟：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個(gè)過(guò)程特稱為核酸印跡(nucleic acid blotting)轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點(diǎn)和狹線印跡法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colony and plaque blotting)；將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標(biāo)記或其它標(biāo)記的DNA或RNA探