【正文】 串聯(lián)重復(fù)區(qū)DNA形成開環(huán)結(jié)構(gòu)；c. DnaB蛋白在DnaC的幫助下與未解鏈序列結(jié)合。每六個DnaB蛋白形成一組并與一條DNA母鏈結(jié)合，可在不同方向同時起始DNA的復(fù)制。當(dāng)細胞中存在足夠的SSB和DNA gyrase時，DnaB的解鏈效率非常高。整個DNA復(fù)制過程中，只有復(fù)制起始受細胞周期的嚴格調(diào)控。Once in each cell cycle。DNA甲基化與DNA復(fù)制起始密切相關(guān)。OriC中有11個GATC回文結(jié)構(gòu)（一般說來，256bp才應(yīng)有一個GATC重復(fù)）。DNA子鏈被合成后，母鏈立即被甲基化（稱為hemimethylated）。此時，oriC與細胞原生質(zhì)膜相結(jié)合。只有當(dāng)oriC被從膜上釋放出來，子鏈被Dam甲基化后，才能有效地與DnaA蛋白結(jié)合，起始新一輪的DNA復(fù)制。復(fù)制起始可能還受ATP水解過程調(diào)控，因為DnaA只有與ATP相結(jié)合時才能與oriC區(qū)DNA相結(jié)合。2. DNA子鏈的延伸主要包括兩個不同但相互有聯(lián)系的事件，即前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。由DNA helicase解開雙螺旋，由拓樸異構(gòu)酶消除DNA鏈上的扭曲力，SSB結(jié)合使DNA單鏈穩(wěn)定。前導(dǎo)鏈的合成：由DnaG（primase）在復(fù)制起始位點附近合成一個1060 nt的RNA引物，然后由polII把dNTP加到該引物上。滯后鏈的合成：產(chǎn)生Okazaki fragments，消除RNA引物并由DNA pol I補上這一小段DNA序列，由DNA Ligase把兩個片段相連。3. DNA鏈的終止當(dāng)子鏈延伸達到terminus region（ter，帶有多個20bp序列）時，DNA復(fù)制就終止了。Ter有點像一個陷井（trap），使復(fù)制叉只能進入，不能出來。Ter的功能主要是由TerTus復(fù)合物（ter utilization substance）來完成的。4. 真核細胞DNA的復(fù)制比大腸桿菌更復(fù)雜真核生物的origin of replication被稱為ARSautonomously replicating sequences或者被稱為replicators。Yeast replicators長約150dp，有多個保守重復(fù)區(qū)，共有約500個replicators分布于酵母的17條染色體中。㈡、DNA的損傷修復(fù)1． 錯配修復(fù)（mismatch Repair）錯配修復(fù)對DNA復(fù)制忠實性的貢獻力達102103，DNA子鏈中的錯配幾乎完全都被修正，充分反映了母鏈的重要性。2. 堿基切除修復(fù)（BaseExcision Repair）DNA gylcosylases能特異性識別常見的DNA損傷（如胞嘧啶或腺嘌呤去氨酰化產(chǎn)物）并將受損害堿基切除。去掉堿基后的核苷酸被稱為AP位點（apurinic or apyrimidinic）。細胞中最常見的Uracil Glycosylase就能特異性切除細胞中的去氨基胞嘧啶。3. 核苷酸切除修復(fù)（nucleotideexcision repair）當(dāng)DNA鏈上相應(yīng)位置的核苷酸發(fā)生損傷，導(dǎo)致雙鏈之間無法形成氫鍵，由核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)負責(zé)進行修復(fù)。（Direct repair） ㈢、DNA的轉(zhuǎn)座DNA的轉(zhuǎn)座，或稱移位（transposition），是由可移位因子（transposable element）介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座這一命名并不十分準確，因為在轉(zhuǎn)座過程中，可移位因子的一個拷貝常常留在原來位置上，在新位點上出現(xiàn)的僅僅是拷貝。因此，轉(zhuǎn)座有別于同源重組，它依賴于DNA的復(fù)制。1． 轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征a. 簡單轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座子（transposon，Tn）是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位。最簡單的轉(zhuǎn)座子不含有任何宿主基因而常被稱為插入序列（insertion sequence，IS），它們是細菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。一個細菌細胞常帶有少于10個IS序列。轉(zhuǎn)座子常常被定位到特定的基因中，造成該基因突變。IS序列都是可以獨立存在的單元，帶有介導(dǎo)自身移動的蛋白。（posite transposon）是一類帶有某些抗藥性基因（或其他宿主基因）的轉(zhuǎn)座子，其兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列，表明IS序列插入到某個功能基因兩端時就可能產(chǎn)生復(fù)合轉(zhuǎn)座子。一旦形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子，IS序列就不能再單獨移動，因為它們的功能被修飾了，只能作為復(fù)合體移動。轉(zhuǎn)座作用的機制轉(zhuǎn)座時發(fā)生的插入作用有一個普遍的特征，那就是受體分子中有一段很短的（312bp）、被稱為靶序列的DNA會被復(fù)制，使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個重復(fù)的靶序列之間。不同轉(zhuǎn)座子的靶序列長度不同，但對于一個特定的轉(zhuǎn)座子來說，它所復(fù)制的靶序列長度都是一樣的，如IS1兩翼總有9個堿基對的靶序列，而Tn3兩端總有5bp的靶序列。轉(zhuǎn)座可被分為復(fù)制性和非復(fù)制性兩大類。在復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，所移動和轉(zhuǎn)位的是原轉(zhuǎn)座子的拷貝。轉(zhuǎn)座酶（transposase）和解離酶（resolvase）分別作用于原始轉(zhuǎn)座子和復(fù)制轉(zhuǎn)座子。TnA類轉(zhuǎn)座主要是這種形式。在非復(fù)制性轉(zhuǎn)座中，原始轉(zhuǎn)座子作為一個可移動的實體直接被移位，IS序列、Mu及Tn5等都以這種方式進行轉(zhuǎn)座。① 轉(zhuǎn)座引起插入突變。② 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因。③ 轉(zhuǎn)座產(chǎn)生的染色體畸變。④ 轉(zhuǎn)座引起的生物進化.六、RNA代謝除了某些RNA病毒之外，所有RNA分子都來自于DNA?；蚪MDNA通過一個被稱為轉(zhuǎn)錄的過程把貯存在雙鏈DNA分子中的遺傳信息轉(zhuǎn)換到與模板DNA鏈相互補的RNA單鏈上。mRNA，編碼了一個或多個蛋白質(zhì)序列；tRNA，把mRNA上的遺傳信息變?yōu)槎嚯闹械陌被嵝畔?；rRNA，是合成蛋白質(zhì)的工廠核糖體中的主要成份。 1． 依賴于DNA的RNA合成從DNA合成反應(yīng)的化學(xué)本質(zhì)、極性和模板的使用這三方面來說，轉(zhuǎn)錄與復(fù)制是相同的。但是，也存在三個主要不同點：A． 轉(zhuǎn)錄中不需要RNA引物；B．轉(zhuǎn)錄反應(yīng)一般只用一小段DNA做模板；C．在轉(zhuǎn)錄區(qū)，一般都只有一條DNA鏈可以作為模板。 一旦RNA聚合酶啟動了基因轉(zhuǎn)錄，它就會沿著模板539。→339。方向不停地移動，合成RNA鏈，直到遇到終止信號時才釋放新生的RNA鏈，并與模板DNA脫離。研究RNA鏈終止時遇到最常見的問題是339。端核苷酸的定位，因為活細胞內(nèi)部根據(jù)終止信號正確終止的RNA與一個經(jīng)過剪接的RNA在339。端沒有兩樣，都是OH基團。模板DNA上都有終止轉(zhuǎn)錄的特殊信號終止子，每個基因或操縱子都有一個啟動子，一個終止子。在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNADNA雜合鏈539。端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的339。端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rUdA區(qū)域。 a. 依賴于ρ因子的終止105的六聚體蛋白，它能水解各種核苷三磷酸，實際上是一種NTP酶。由于催化了NTP的水解，ρ因子能促使新生的RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。有人認為，在RNA合成起始以后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的能量，沿著539?！?39。方向朝RNA聚合酶移動，到達RNA的339。OH端后取代了暫停在終止位點上的RNA聚合酶，并從模板和酶上釋放RNA，完成轉(zhuǎn)錄過程。終止過程需要消耗能量，所以，ρ因子具有終止轉(zhuǎn)錄和核苷三磷酸酶兩種功能。 b、不依賴于ρ 因子的終止若終止點上游存在一個富含GC堿基的二重對稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)；在終止點前面有一段由48個A組成的序列，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3‘端為寡聚U。這兩種結(jié)構(gòu)特征的存在同樣決定了轉(zhuǎn)錄的終止。 在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNADNA雜合鏈539。端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈的339。端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的rUdA區(qū)域。 TFⅡH還參與DNA的損傷修復(fù)。當(dāng)RNA polⅡ轉(zhuǎn)錄過程中碰到受損傷的核苷酸時，TFⅡH能及時啟動核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)，將損傷修復(fù)。 Actinomycin D和Acridine阻斷RNA鏈的延伸 所以，RNA加工成熟主要包括：5’加帽子結(jié)構(gòu)；3’加多聚A；切除內(nèi)含子 。在Group I內(nèi)含子切除體系中，鳥苷或鳥苷酸的339。OH 作為親核基團向Intron 539。的磷酸二酯鍵發(fā)起進攻。Group II內(nèi)含子切除體系核內(nèi)mRNA原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪輯方式可能是最常見的。在這一模式中，RNA的剪輯需要特異性RNAprotein復(fù)合物small nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和small nuclear RNAs（snRNAs）。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有5種snRNAsU1，U2，U4，U5，U6。 第五講 分子生物學(xué)研究法一、 重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題； 保留復(fù)制機制,解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；，相繼提出了中心法則和操縱子學(xué)說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。年份 事 件 1869 F Miescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。 1944 . Avery證實DNA是遺傳物質(zhì)。 1952 . 。 1953 。 1957 。 1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留復(fù)制模型。 19591960 S. Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。 1961 Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F. Jacob和J. Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達的操縱子模型。 1964 C. Yanofsky和S. Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。 1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測定；科學(xué)家證明細菌的抗藥性通常由質(zhì)粒DNA所決定。 1966 ，、。 1970 。 19721973 ，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細菌基因克隆。 19751977 、。1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測定。 1978 首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素。 1980 美國聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。 1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。 1982 美、英批準使用第一例基因工程藥物胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。 1983 獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。 1984 斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。 1986 GMO首次在環(huán)境中釋放。 1988 J. D. Watson出任人類基因組計劃首席科學(xué)家。 1989 DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小氧Onouse。 1992 歐共體35個實驗室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測定(315kb) 1994 第一批基因工程西紅柿在美國上市。 1996 完成了酵母基因組(107bp)全序列測定。 1997 英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。 基因工程中常見的名詞:遺傳工程genetic engineering，基因操作gone manipulation，基因克隆gone cloning，重組DNA技術(shù)rebinant DNA technology，分子克隆molecular cloning?；蚬こ痰闹饕獌?nèi)容或步驟:1. 從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2. 將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3. 將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。4. 從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經(jīng)得到擴增的目的基因。5. 將目的基因克隆到表達載體上，導(dǎo)入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。二、 基因操作的主要技術(shù)原理1． 核酸的凝膠電泳(Agarose amp。amp。 Polyacrylamide)將某種分子放到特定的電場中，它就會以一定的速度向適當(dāng)?shù)碾姌O移動。某物質(zhì)在電場作用下的遷移速度叫作電泳的速率，它與電場強度成正比，與該分子所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，而與分子的磨擦系數(shù)成反比（分子大小、極性、介質(zhì)的粘度系數(shù)等）。在生理條件下，核酸分子中的磷酸基團是離子化的，所以，DNA和RNA實際上呈多聚陰離子狀態(tài)（Polyanions）。將DNA、RNA放到電場中，它就會由負極→正極移動。在凝膠電泳中，一般加入溴化乙錠（EB）ethidium bromide染色，此時，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約50ng DNA所形成的條帶。DNA的脈沖電泳技術(shù) :PFGEPulsefield gel electrophoresis2． 核酸的分子雜交技術(shù)在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳 分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動地吸印 轉(zhuǎn)移到濾膜上的。常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）等。核酸分子雜交實驗包括如下兩個步驟：將核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上，這個過程特稱為核酸印跡(nucleic acid blotting)轉(zhuǎn)移，主要有電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印跡法(colony and plaque blotting)；將具有核酸印跡的濾膜同帶有放射性標記或其它標記的DNA或RNA探