【正文】 蛋白質(zhì)合成時(shí)，空轉(zhuǎn)反應(yīng)，消耗GTP，生成GDP，產(chǎn)生嚴(yán)謹(jǐn)因子催化下列反應(yīng)： 嚴(yán)謹(jǐn)因子ATP+GDP PPPGPP或PPGPP 與RNA pol E 形成復(fù)合物使酶活性下降二. 原核基因翻譯水平調(diào)控（一） 反義RNA的調(diào)控作用反義RNA是指能與特定mRNA互補(bǔ)結(jié)合的RNA片段，又叫干擾mRNA的互補(bǔ)RNA，即micRNA。由反義RNA基因轉(zhuǎn)錄而來。其調(diào)控為翻譯水平的調(diào)控，有三種方式：與mRNA 5′端非轉(zhuǎn)譯區(qū)包括SD序列相結(jié)合（SD序列是mRNA與核糖體小亞基結(jié)合的部位）與mRNA 5′端編碼區(qū)起始密碼子AUG結(jié)合與靶mRNA的非編碼區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，使mRNA構(gòu)象改變影響其與核糖體的結(jié)合 滲透壓對大腸桿菌外膜蛋白Omp C和Omp F 合成的調(diào)節(jié)就是通過反義RNA (mic RNA)調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。（二） mRNA的穩(wěn)定性增加mRNA 的穩(wěn)定性，延長 mRNA壽命，可提高翻譯水平。（三） 核糖體蛋白自體調(diào)控 與rRNA結(jié)合成核糖體 核糖體蛋白 與mRNA結(jié)合阻止翻譯第三節(jié) 真核基因表達(dá)的調(diào)控一、真核基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（一） 真核基因組結(jié)構(gòu)龐大（二）單順反子（三）重復(fù)序列（四）基因不連續(xù)性多順反子：細(xì)菌大多數(shù)基因按功能相關(guān)性成簇地形成操縱子，由操縱子機(jī)制控制轉(zhuǎn)錄生成的mRNA是多順反子，即一個(gè)mRNA分子編碼幾個(gè)功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。單順反子：真核生物轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA分子，經(jīng)翻譯生成一條多肽鏈，真核基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。二、真核基因表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)（一） RNA聚合酶（二）活性染色體結(jié)構(gòu)變化（三）正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)（四）轉(zhuǎn)錄與翻譯分隔進(jìn)行（五）轉(zhuǎn)錄后加工、修飾三. 基因組水平調(diào)控（一） 基因易位（二）基因擴(kuò)增（三） 基因重排（四） DNA 甲基化四. 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控多級調(diào)控中，主要在轉(zhuǎn)錄水平通過順式作用元件和反式作用因子相互作用來實(shí)現(xiàn)。（一） 順式作用元件 啟動(dòng)子 增強(qiáng)子 沉默子增 強(qiáng)子：由約200bp的DNA序列組成其作用在于增加轉(zhuǎn)錄的頻率。增強(qiáng)子的特點(diǎn)有：1. 可以在很遠(yuǎn)的距離（130kb）作用于順式連接的啟動(dòng)子。2. 增強(qiáng)子的作用是沒有方向性的3. 增強(qiáng)子既可位于啟動(dòng)子的上游，也可位于啟動(dòng)子的下 游，還可位于啟動(dòng)子內(nèi)部4. 增強(qiáng)子無基因的特異性，對各種基因的啟動(dòng)子均有作用，但有組織特異性。（二） 反式作用因子1. 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子分類（按功能特性） 基本轉(zhuǎn)錄因子： 指普遍存在于各種細(xì)胞中、結(jié)合在TATA盒附近的轉(zhuǎn)錄因子，主要參與RNA聚合酶與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近的DNA特異序列形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。 特異轉(zhuǎn)錄因子：為個(gè)別基因轉(zhuǎn)錄所需，決定該基因的時(shí)間、空間特異性表達(dá)。有轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄抑制因子兩種2. 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)構(gòu)三個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域：DNA 結(jié)構(gòu)區(qū)域，轉(zhuǎn)錄結(jié)合激活域，二聚話結(jié)構(gòu)域五. 轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控（一） mRNA前體加工，5’端加m 7 G帽，3’端加pol A 尾，這兩個(gè)因素保證mRNA在轉(zhuǎn)錄過程中不被降解。（二）mRNA選擇性剪接對基因表達(dá)的調(diào)控作用1. mRNA選擇剪接 1）外顯子選擇 ，也稱外顯子跳躍：一是外顯子全部保留，二是刪除一個(gè)或幾個(gè)外顯子。2）互斥外顯子一對外顯子中，二者不能同時(shí)出現(xiàn)在同一個(gè)成熟的mRNA中。2. 選擇剪接對基因表達(dá)的調(diào)控作用Bax基因編碼產(chǎn)生幾種蛋白，緣于mRNA的選擇剪接形成不同的表達(dá)產(chǎn)物。六. 翻譯水平調(diào)控（一）翻譯起始的調(diào)控 起始因子可逆磷酸化是常見的調(diào)節(jié)方式，如血紅素對翻譯起始因子的調(diào)控制。（二） mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)真核基因，mRNA的穩(wěn)定性差別很大，為珠蛋白的，半衰期10小時(shí)以上，而有些只有30分鐘。3’端非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)（AU豐富區(qū)）影響mRNA的穩(wěn)定性。（三） 小分子RNA(lin4RNA的影響1993年發(fā)現(xiàn)一種小分子lin4RNA像霉和調(diào)節(jié)蛋白那樣對真核生物的翻譯起阻抑作用。七. 翻譯后水平的調(diào)控（一）高級結(jié)構(gòu)的修飾1. 亞基聚合2. 輔基連接（二） 一級結(jié)構(gòu)的修飾、運(yùn)輸和定位。分子克?。ɑ蚬こ蹋┣把远兰o(jì)40年代，基因分子生物學(xué)家確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)二十世紀(jì)40年代，基因分子生物學(xué)家確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì) 50年代，Waston和Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制深刻意義在于：解決了基因自我復(fù)制和遺傳信息的傳遞問題50年代末和60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說，并成功破譯了遺傳密碼。從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題DNA(自主復(fù)制)轉(zhuǎn)錄mRNA，tRNA,rRNA翻譯蛋白質(zhì):RNA逆轉(zhuǎn)錄形成DNA這些都為基因工程的誕生奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ) 基因工程的誕生70年代初，DNA限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和一整套DNA體外重組技術(shù)又為基因工程的發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。1972年，（一種猴病毒）的DNA和噬菌體DNA分別切割，又將兩者接在一起，成功地構(gòu)建了第一個(gè)體外重組的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次將體外重組的DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌中，成功地進(jìn)行了無性繁殖，從而完成了DNA體外重組和擴(kuò)增的全過程?；蚬こ踢@門新興學(xué)科也就由此誕生了。 基本概念基因工程的核心是重組DNA技術(shù)，又叫DNA克隆。所謂克隆是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相同的子代群體。在基因工程中所指的克隆，是指在體外對DNA分子按照既定目的和方案進(jìn)行人工重組，并將重組分子導(dǎo)入適合的宿主細(xì)胞，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該DNA分子的大量拷貝。這類克隆是在分子水平上操作，故又稱分子克隆。由于研究對象常常是特異的基因片段，所以又稱作基因克隆。實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)工作統(tǒng)稱為基因工程。基因工程與當(dāng)前發(fā)展的蛋白質(zhì)工程、酶工程以及細(xì)胞工程共同構(gòu)成了當(dāng)代新興的學(xué)科領(lǐng)域——生物技術(shù)工程。生物技術(shù)工程的興起為現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展和工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的進(jìn)步提供了巨大動(dòng)力。細(xì)胞克隆技術(shù)：在制備單克隆抗體的B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)中運(yùn)用的最為充分。哺乳動(dòng)物的克隆：克隆概念在個(gè)體水平上的應(yīng)用采用了核質(zhì)分離、細(xì)胞融合、體外培養(yǎng)及胚胎移植等技術(shù) 主要內(nèi)容①從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，分離出目的基因片段。②在體外，將目的基因片段連接到能自我復(fù)制的并且具有選擇標(biāo)記的載體分子上，形成重組DNA分子。③將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞（亦稱宿主細(xì)胞），并與之一起增殖。④篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。⑤從篩選出的陽性克隆中提取出擴(kuò)增的目的基因片段，供進(jìn)一步研究使用。⑥將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)。應(yīng)用實(shí)例重組DNA技術(shù)跨越天然物種屏障，將原核和真核生物，植物和動(dòng)物，細(xì)菌和人，動(dòng)物和人的基因連接起來，進(jìn)行基因交流。利用大腸桿菌（)、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來生產(chǎn)人類所需要的，從其他方法又難以大量獲得的重組蛋白質(zhì)。第一個(gè)用細(xì)菌表達(dá)的用于人類的基因重組藥物——人胰島素上市（ 1979年美國基因技術(shù)公司）牛、豬胰島素，免疫反應(yīng)?；瘜W(xué)合成人胰島素基因。融合蛋白。溴化氰水解?；旌现亟ㄓ媒湍讣?xì)胞生產(chǎn)乙型肝炎病毒亞單位疫苗乙肝病毒包括包膜蛋白，核心蛋白，病毒DNA用基因工程方法制備乙肝表面包膜蛋白為抗原亞單位疫苗無致病力，很安全、高效。生物鋼目前世界范圍內(nèi)開發(fā)的基因工程多肽藥物、疫苗、抗體有五百多種 理論意義徹底填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝重組技術(shù)縮短了進(jìn)化單位能按人們的意愿定向改造、培育新品種解決醫(yī)學(xué)與生物學(xué)上長期無法解決的許多重大（如是什么基因、在什么地方、什么時(shí)間、起什么作用？如何起作用？）人們預(yù)言，21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì)，以基因工程為主導(dǎo)的生物技術(shù)可能對世界的重大問題－－饑餓、疾病、能源、污染等提出切實(shí)的解決辦法，推動(dòng)社會(huì)生產(chǎn)力的飛速發(fā)展。一、分子克隆中常用的工具酶在重組DNA與基因工程中，對目的基因的分離、剪切和重組涉及到一系列酶催化反應(yīng)，這些酶就像外科醫(yī)生的手術(shù)刀一樣，是進(jìn)行基因工程操作必不可少的工具。常分為限制性核酸內(nèi)切酶、連接酶和核酸修飾酶。限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶是指能識(shí)別DNA的特殊序列，并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類酶。它主要來源于原核生物，可將侵入宿主細(xì)胞的外源性DNA迅速降解，而對細(xì)菌自身的DNA，則通過甲基化酶在該種限制酶切位點(diǎn)甲基化修飾而保護(hù)自身的DNA不被降解。 限制性內(nèi)切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。限制性核酸內(nèi)切酶的命名命名是根據(jù)含有該酶的微生物種屬而定。通常有三個(gè)斜體字母的縮寫表示。第一個(gè)大寫字母取自細(xì)菌屬名的第一個(gè)字母；第二、三個(gè)小寫字母取自微生物種名的頭兩個(gè)字母；第四個(gè)字母代表該微生物同種內(nèi)不同的株系；如果同一株名發(fā)現(xiàn)幾種限制酶，則根據(jù)其被發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序，用羅馬數(shù)字表示。 例如，從大腸桿菌（Escherichia Coli）RY13株中發(fā)現(xiàn)分離的第一種限制酶，稱為EcoR I。限制酶的分類及特點(diǎn) 根據(jù)限制酶的組成、輔因子及切割DNA方式不同，可分為I、II、III型。重組DNA技術(shù)中常用的是II型限制性內(nèi)切酶。II型酶作用特點(diǎn)是有嚴(yán)格的識(shí)別、切割順序，以內(nèi)切方式水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產(chǎn)生的DNA片段5‘ 端為磷酸基，3’ 端為羥基。識(shí)別順序一般為4－6個(gè)堿基，通常是回文結(jié)構(gòu)（palindrome）。識(shí)別序列的大小決定其切割DNA后產(chǎn)生的片段的長短。44＝2546＝40948＝65536II型酶切割雙鏈DNA產(chǎn)生3種不同的切口：⑴在對稱軸中心同時(shí)切割雙鏈，產(chǎn)生平末端或稱鈍性末端，如Hpa I： 539。 …GTT▼AAC…339。 Hpa I 539。 …GTT AAC…3‘ 339。 …CAA▲TTG…539。 339。 …CAA TTG … 539。 ⑵在對稱軸兩側(cè)相對位點(diǎn)分別切割一條鏈。從539。 端切割產(chǎn)生539。 端突出的粘性末端，如EcoR I： 539。 …G▼AATT C…339。 EcoR I 539。 …G AATTC…339。 339。 …C TTAA▲G…539。 339。 …CTTAA G… 539。 ⑶從339。 端切割產(chǎn)生339。 端突出的粘性末端。如Pst I： 539。 …C TGCA▼G…339。 Pst I 539。 …CTGCA G…3‘ 339。 …G▲ACGT C…539。 339。 …G ACGTC… 539。 同工異源酶1. 定義：能識(shí)別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶2. 特點(diǎn)：1）識(shí)別相同順序 2）切割位點(diǎn)的異同 KpnI GGTAC C 　　SstI 　 CCGC GG 　 Asp718 G GTACC 　　SacI 　 CCGC GG同尾酶有些限制酶識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端，稱這些酶為同尾酶。如：BamH I (G GATCC)和Sau3A I (N GATCN)由此產(chǎn)生的DNA片段可借粘性末端相互連接，在DNA重組時(shí)具有更大的靈活性星號(hào)活力： 限制性內(nèi)切酶在非標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，能夠切割一些與其特異性識(shí)別順序類似的序列，這種現(xiàn)象稱星號(hào)活力。5‘ …G▼AATT C…3’ 5‘ …N▼AATT N …3’ 星號(hào)活力 EcoR I * 誘發(fā)星號(hào)活力常見原因：高甘油含量（5%，V/V）內(nèi)切酶用量過大， （100U/181。gDNA）低離子強(qiáng)度：25mmol/L高pH值：pH 8含有機(jī)溶劑：二甲基亞砜、乙醇、乙烯二乙醇等6 、有Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+等非Mg2+的二價(jià)陽離子。 。應(yīng)用在分子生物學(xué)和基因工程中具有舉足輕重的地位。其主要?jiǎng)儆猛荆焊脑旒敖M建質(zhì)粒組建基因組DNA物理圖譜基因組DNA同源性研究DNA重組克隆及亞克隆DNA雜交與序列分析注意事項(xiàng)1酶切底物DNA要純，抽提時(shí)酚／氯仿要去除干凈。2所加酶量不應(yīng)超過10％（RE保存在50％的甘油中－20度較穩(wěn)定）。3取酶時(shí)量要準(zhǔn)，最后加酶，最好在冰箱里加。4酶切反應(yīng)2小時(shí)左右，可延長，節(jié)約酶量。5兩種酶有相同的緩沖液，可雙酶切；不同，先用需低鹽緩沖液的限制酶消化，再用需高鹽緩沖液的酶消化。DNA連接酶連接酶可催化DNA分子中相鄰539。 磷酸基和339。 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接。常用的有T4（噬菌體） DNA連接酶。DNA聚合酶 重組DNA技術(shù)中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA為模板在體外合成DNA或RNA?？煞譃镈NA聚合酶和RNA聚合酶兩大類。RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA。常用于離體條件下，合成單鏈R