【正文】 蛋白質合成時，空轉反應，消耗GTP，生成GDP，產生嚴謹因子催化下列反應： 嚴謹因子ATP+GDP PPPGPP或PPGPP 與RNA pol E 形成復合物使酶活性下降二. 原核基因翻譯水平調控（一） 反義RNA的調控作用反義RNA是指能與特定mRNA互補結合的RNA片段，又叫干擾mRNA的互補RNA，即micRNA。由反義RNA基因轉錄而來。其調控為翻譯水平的調控，有三種方式：與mRNA 5′端非轉譯區(qū)包括SD序列相結合（SD序列是mRNA與核糖體小亞基結合的部位）與mRNA 5′端編碼區(qū)起始密碼子AUG結合與靶mRNA的非編碼區(qū)互補結合，使mRNA構象改變影響其與核糖體的結合 滲透壓對大腸桿菌外膜蛋白Omp C和Omp F 合成的調節(jié)就是通過反義RNA (mic RNA)調控實現(xiàn)的。（二） mRNA的穩(wěn)定性增加mRNA 的穩(wěn)定性，延長 mRNA壽命，可提高翻譯水平。（三） 核糖體蛋白自體調控 與rRNA結合成核糖體 核糖體蛋白 與mRNA結合阻止翻譯第三節(jié) 真核基因表達的調控一、真核基因組結構特點（一） 真核基因組結構龐大（二）單順反子（三）重復序列（四）基因不連續(xù)性多順反子：細菌大多數(shù)基因按功能相關性成簇地形成操縱子，由操縱子機制控制轉錄生成的mRNA是多順反子，即一個mRNA分子編碼幾個功能相關的蛋白質。單順反子：真核生物轉錄生成一個mRNA分子，經翻譯生成一條多肽鏈，真核基因轉錄產物為單順反子。二、真核基因表達調控特點（一） RNA聚合酶（二）活性染色體結構變化（三）正性調節(jié)占主導（四）轉錄與翻譯分隔進行（五）轉錄后加工、修飾三. 基因組水平調控（一） 基因易位（二）基因擴增（三） 基因重排（四） DNA 甲基化四. 轉錄水平調控多級調控中，主要在轉錄水平通過順式作用元件和反式作用因子相互作用來實現(xiàn)。（一） 順式作用元件 啟動子 增強子 沉默子增 強子：由約200bp的DNA序列組成其作用在于增加轉錄的頻率。增強子的特點有：1. 可以在很遠的距離（130kb）作用于順式連接的啟動子。2. 增強子的作用是沒有方向性的3. 增強子既可位于啟動子的上游，也可位于啟動子的下 游，還可位于啟動子內部4. 增強子無基因的特異性，對各種基因的啟動子均有作用，但有組織特異性。（二） 反式作用因子1. 轉錄調節(jié)因子分類（按功能特性） 基本轉錄因子： 指普遍存在于各種細胞中、結合在TATA盒附近的轉錄因子，主要參與RNA聚合酶與轉錄起始點附近的DNA特異序列形成穩(wěn)定的轉錄起始復合物。 特異轉錄因子：為個別基因轉錄所需，決定該基因的時間、空間特異性表達。有轉錄激活因子和轉錄抑制因子兩種2. 轉錄調節(jié)因子結構三個結構區(qū)域：DNA 結構區(qū)域，轉錄結合激活域，二聚話結構域五. 轉錄后水平調控（一） mRNA前體加工，5’端加m 7 G帽，3’端加pol A 尾，這兩個因素保證mRNA在轉錄過程中不被降解。（二）mRNA選擇性剪接對基因表達的調控作用1. mRNA選擇剪接 1）外顯子選擇 ，也稱外顯子跳躍：一是外顯子全部保留，二是刪除一個或幾個外顯子。2）互斥外顯子一對外顯子中，二者不能同時出現(xiàn)在同一個成熟的mRNA中。2. 選擇剪接對基因表達的調控作用Bax基因編碼產生幾種蛋白，緣于mRNA的選擇剪接形成不同的表達產物。六. 翻譯水平調控（一）翻譯起始的調控 起始因子可逆磷酸化是常見的調節(jié)方式，如血紅素對翻譯起始因子的調控制。（二） mRNA穩(wěn)定性的調節(jié)真核基因，mRNA的穩(wěn)定性差別很大，為珠蛋白的，半衰期10小時以上，而有些只有30分鐘。3’端非編碼區(qū)結構（AU豐富區(qū)）影響mRNA的穩(wěn)定性。（三） 小分子RNA(lin4RNA的影響1993年發(fā)現(xiàn)一種小分子lin4RNA像霉和調節(jié)蛋白那樣對真核生物的翻譯起阻抑作用。七. 翻譯后水平的調控（一）高級結構的修飾1. 亞基聚合2. 輔基連接（二） 一級結構的修飾、運輸和定位。分子克隆（基因工程）前言二十世紀40年代，基因分子生物學家確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質二十世紀40年代，基因分子生物學家確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質 50年代，Waston和Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制深刻意義在于：解決了基因自我復制和遺傳信息的傳遞問題50年代末和60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說，并成功破譯了遺傳密碼。從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題DNA(自主復制)轉錄mRNA，tRNA,rRNA翻譯蛋白質:RNA逆轉錄形成DNA這些都為基因工程的誕生奠定了堅實的理論基礎 基因工程的誕生70年代初，DNA限制性內切酶的發(fā)現(xiàn)和一整套DNA體外重組技術又為基因工程的發(fā)展奠定了堅實的技術基礎。1972年，（一種猴病毒）的DNA和噬菌體DNA分別切割，又將兩者接在一起，成功地構建了第一個體外重組的人工DNA分子。1973年，Cohen等人首次將體外重組的DNA分子導入大腸桿菌中，成功地進行了無性繁殖，從而完成了DNA體外重組和擴增的全過程?；蚬こ踢@門新興學科也就由此誕生了。 基本概念基因工程的核心是重組DNA技術，又叫DNA克隆。所謂克隆是指通過無性繁殖過程所產生的與親代完全相同的子代群體。在基因工程中所指的克隆，是指在體外對DNA分子按照既定目的和方案進行人工重組，并將重組分子導入適合的宿主細胞，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得該DNA分子的大量拷貝。這類克隆是在分子水平上操作，故又稱分子克隆。由于研究對象常常是特異的基因片段，所以又稱作基因克隆。實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關工作統(tǒng)稱為基因工程。基因工程與當前發(fā)展的蛋白質工程、酶工程以及細胞工程共同構成了當代新興的學科領域——生物技術工程。生物技術工程的興起為現(xiàn)代科學技術發(fā)展和工農業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的進步提供了巨大動力。細胞克隆技術：在制備單克隆抗體的B淋巴細胞雜交瘤技術中運用的最為充分。哺乳動物的克隆：克隆概念在個體水平上的應用采用了核質分離、細胞融合、體外培養(yǎng)及胚胎移植等技術 主要內容①從復雜的生物有機體基因組中，分離出目的基因片段。②在體外，將目的基因片段連接到能自我復制的并且具有選擇標記的載體分子上，形成重組DNA分子。③將重組DNA分子轉移到適當?shù)氖荏w細胞（亦稱宿主細胞），并與之一起增殖。④篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞克隆。⑤從篩選出的陽性克隆中提取出擴增的目的基因片段，供進一步研究使用。⑥將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之實現(xiàn)功能表達。應用實例重組DNA技術跨越天然物種屏障，將原核和真核生物，植物和動物，細菌和人，動物和人的基因連接起來，進行基因交流。利用大腸桿菌（)、酵母、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)來生產人類所需要的，從其他方法又難以大量獲得的重組蛋白質。第一個用細菌表達的用于人類的基因重組藥物——人胰島素上市（ 1979年美國基因技術公司）牛、豬胰島素，免疫反應?；瘜W合成人胰島素基因。融合蛋白。溴化氰水解。混合重建用酵母細胞生產乙型肝炎病毒亞單位疫苗乙肝病毒包括包膜蛋白，核心蛋白，病毒DNA用基因工程方法制備乙肝表面包膜蛋白為抗原亞單位疫苗無致病力，很安全、高效。生物鋼目前世界范圍內開發(fā)的基因工程多肽藥物、疫苗、抗體有五百多種 理論意義徹底填平了生物種屬間不可逾越的鴻溝重組技術縮短了進化單位能按人們的意愿定向改造、培育新品種解決醫(yī)學與生物學上長期無法解決的許多重大（如是什么基因、在什么地方、什么時間、起什么作用？如何起作用？）人們預言，21世紀是生命科學的世紀，以基因工程為主導的生物技術可能對世界的重大問題－－饑餓、疾病、能源、污染等提出切實的解決辦法，推動社會生產力的飛速發(fā)展。一、分子克隆中常用的工具酶在重組DNA與基因工程中，對目的基因的分離、剪切和重組涉及到一系列酶催化反應，這些酶就像外科醫(yī)生的手術刀一樣，是進行基因工程操作必不可少的工具。常分為限制性核酸內切酶、連接酶和核酸修飾酶。限制性核酸內切酶 限制性核酸內切酶是指能識別DNA的特殊序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類酶。它主要來源于原核生物，可將侵入宿主細胞的外源性DNA迅速降解，而對細菌自身的DNA，則通過甲基化酶在該種限制酶切位點甲基化修飾而保護自身的DNA不被降解。 限制性內切酶由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。限制性核酸內切酶的命名命名是根據(jù)含有該酶的微生物種屬而定。通常有三個斜體字母的縮寫表示。第一個大寫字母取自細菌屬名的第一個字母；第二、三個小寫字母取自微生物種名的頭兩個字母；第四個字母代表該微生物同種內不同的株系；如果同一株名發(fā)現(xiàn)幾種限制酶，則根據(jù)其被發(fā)現(xiàn)和分離的先后順序，用羅馬數(shù)字表示。 例如，從大腸桿菌（Escherichia Coli）RY13株中發(fā)現(xiàn)分離的第一種限制酶，稱為EcoR I。限制酶的分類及特點 根據(jù)限制酶的組成、輔因子及切割DNA方式不同，可分為I、II、III型。重組DNA技術中常用的是II型限制性內切酶。II型酶作用特點是有嚴格的識別、切割順序，以內切方式水解雙鏈DNA中的磷酸二酯鍵，產生的DNA片段5‘ 端為磷酸基，3’ 端為羥基。識別順序一般為4－6個堿基，通常是回文結構（palindrome）。識別序列的大小決定其切割DNA后產生的片段的長短。44＝2546＝40948＝65536II型酶切割雙鏈DNA產生3種不同的切口：⑴在對稱軸中心同時切割雙鏈，產生平末端或稱鈍性末端，如Hpa I： 539。 …GTT▼AAC…339。 Hpa I 539。 …GTT AAC…3‘ 339。 …CAA▲TTG…539。 339。 …CAA TTG … 539。 ⑵在對稱軸兩側相對位點分別切割一條鏈。從539。 端切割產生539。 端突出的粘性末端，如EcoR I： 539。 …G▼AATT C…339。 EcoR I 539。 …G AATTC…339。 339。 …C TTAA▲G…539。 339。 …CTTAA G… 539。 ⑶從339。 端切割產生339。 端突出的粘性末端。如Pst I： 539。 …C TGCA▼G…339。 Pst I 539。 …CTGCA G…3‘ 339。 …G▲ACGT C…539。 339。 …G ACGTC… 539。 同工異源酶1. 定義：能識別相同序列但來源不同的兩種或多種限制酶2. 特點：1）識別相同順序 2）切割位點的異同 KpnI GGTAC C 　　SstI 　 CCGC GG 　 Asp718 G GTACC 　　SacI 　 CCGC GG同尾酶有些限制酶識別序列不同，但產生相同的粘性末端，稱這些酶為同尾酶。如：BamH I (G GATCC)和Sau3A I (N GATCN)由此產生的DNA片段可借粘性末端相互連接，在DNA重組時具有更大的靈活性星號活力： 限制性內切酶在非標準反應條件下，能夠切割一些與其特異性識別順序類似的序列，這種現(xiàn)象稱星號活力。5‘ …G▼AATT C…3’ 5‘ …N▼AATT N …3’ 星號活力 EcoR I * 誘發(fā)星號活力常見原因：高甘油含量（5%，V/V）內切酶用量過大， （100U/181。gDNA）低離子強度：25mmol/L高pH值：pH 8含有機溶劑：二甲基亞砜、乙醇、乙烯二乙醇等6 、有Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+等非Mg2+的二價陽離子。 。應用在分子生物學和基因工程中具有舉足輕重的地位。其主要勝用途：改造及組建質粒組建基因組DNA物理圖譜基因組DNA同源性研究DNA重組克隆及亞克隆DNA雜交與序列分析注意事項1酶切底物DNA要純，抽提時酚／氯仿要去除干凈。2所加酶量不應超過10％（RE保存在50％的甘油中－20度較穩(wěn)定）。3取酶時量要準，最后加酶，最好在冰箱里加。4酶切反應2小時左右，可延長，節(jié)約酶量。5兩種酶有相同的緩沖液，可雙酶切；不同，先用需低鹽緩沖液的限制酶消化，再用需高鹽緩沖液的酶消化。DNA連接酶連接酶可催化DNA分子中相鄰539。 磷酸基和339。 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接。常用的有T4（噬菌體） DNA連接酶。DNA聚合酶 重組DNA技術中，聚合酶（polymerase）的最重要作用是以DNA或RNA為模板在體外合成DNA或RNA?？煞譃镈NA聚合酶和RNA聚合酶兩大類。RNA聚合酶以DNA為模板合成RNA。常用于離體條件下，合成單鏈R