【正文】 抑制細(xì)胞過度增殖過程中起重要作用。P53蛋白隨時(shí)監(jiān)控染色體DNA的完整性，一組DNA遭受損害， P53蛋白將與特定的DNA序列結(jié)合，通過激活P21基因等過程，使DNA得到完全修復(fù)。如果修復(fù)失敗， P53即啟動(dòng)促凋亡過程誘導(dǎo)該細(xì)胞自殺，防止轉(zhuǎn)變成惡性細(xì)胞。８、 什么是顯性負(fù)突變？９、 答：突變的P53蛋白能與野生型P53結(jié)合形成無功能寡聚蛋白，使野生型P53蛋白失活，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，稱顯性負(fù)突變。１０、 細(xì)胞癌基因、抑癌基因在腫瘤發(fā)生中的作用是什么？答：癌基因：因基因突變而激活，細(xì)胞過度增殖而癌變。腫瘤抑制基因：因突變而失活，不能正常地抑制細(xì)胞過度增殖，于是細(xì)胞惡性增長(zhǎng)。１１、 癌基因、抑癌基因、細(xì)胞凋亡基因、ＤＮＡ損傷修復(fù)基因在腫瘤發(fā)生中的作用是什么？答：癌基因：因基因突變而激活，細(xì)胞過度增殖而癌變。腫瘤抑制基因：因突變而失活，不能正常地抑制細(xì)胞過度增殖，于是細(xì)胞惡性增長(zhǎng)。細(xì)胞凋亡基因：它保證細(xì)胞的正常程序性死亡，即正常凋亡。細(xì)胞凋亡基因有多種，主要有BCl家族，它又分為促凋亡基因及抑凋亡基因。第二十五章　　　　基因診斷及基因治療１、 什么是分子診斷？什么是基因診斷？答：（1）、用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)在分子水平上對(duì)引起疾病的遺傳基因、病原體及腫瘤相關(guān)基因以及他們的表達(dá)產(chǎn)物RNA（尤其是mRNA）和蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)定性及定量分析，從而對(duì)疾病做出診斷。稱之為分子診斷（molecular diagnosis）。 （2）、DNA、RNA（尤其是mRNA）是遺傳信息的載體，針對(duì)分析這些信息分子的序列結(jié)構(gòu)、基因變異導(dǎo)致功能改變而引起疾病發(fā)生，稱之為基因診斷（gene diagnosis）。２、 基因診斷的優(yōu)點(diǎn)有哪些？答：1. 特異性：針對(duì)特定基因，采用核酸雜交、 PCR技術(shù)等進(jìn)行診斷，表現(xiàn)高度特異性。 2. 高度敏感性：基因診斷采用PCR技術(shù)，具有放大效應(yīng)。故其靈敏度高。 3. 基因診斷是在源頭上認(rèn)識(shí)基因是否正常及其與疾病發(fā)生的關(guān)系。 4. 適用性：診斷范圍廣。基因診斷即可診斷引起疾病的基因，也可診斷引起腫瘤的相關(guān)基因，還能診斷病原體基因，從而確定相應(yīng)病原體的存在。３、 基因診斷的基本條件是什么？答：。、功能及基因克隆的相關(guān)知識(shí)已解釋 清楚或基本清楚。因此，對(duì)于一種疾病表型及其相關(guān)基因型的有關(guān)知識(shí)一點(diǎn)都不清楚，是無法進(jìn)行基因診斷的。，基因診斷僅僅只能用于單基因病的基因診斷。如：β地中海貧血、G6PD缺陷病、PKV、高LDL血癥等。而對(duì)于多基因病的基因診斷，目前還處于研究過程中。４、 基因診斷用樣品主要有哪些？答：：血液、組織塊、羊水和絨毛、毛發(fā)、精液、唾液、尿液等。、各種RNA（尤其是mRNA）。，可用提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。，樣品必須新鮮。固RNA不，易受細(xì)胞內(nèi)RNA酶的降解。在從樣品中提取RNA時(shí)，要加入RNA保護(hù)劑DEPC（焦炭酸二乙酸），可從羊水細(xì)胞、絨毛細(xì)胞或臍帶血有核血細(xì)胞，母親外周血中分離出的胎兒有核血細(xì)胞中提取DNA。５、 基因診斷的基本步驟有哪些？答：1. 獲取相應(yīng)的樣品：血液白細(xì)胞、羊水細(xì)胞、精細(xì)胞等。 2. 從樣品中提取基因組DNA、總RNA。 3. 目的基因（序列）的PCR擴(kuò)增。 4. 核酸分子雜交及雜交信號(hào)的檢測(cè)。６、 基因缺失或插入的診斷方法有哪些？試述之？答：1. DNA印跡法：即Southern印跡。根據(jù)印跡片段的大?。娪緟^(qū)帶位置）即可判斷基因缺失或插入?；蚱巫冃。娪舅俾士欤┱f明存在基因缺失?；蚱巫兇笳f明存在基因插入。但方法繁瑣不易臨床常規(guī)開展。2. PCR法：基因的堿基缺失或插入部位稱之為斷裂點(diǎn)。采用跨越斷裂點(diǎn)PCR技術(shù)（GapPCR），就能簡(jiǎn)便靈敏的檢測(cè)出基因缺失或插入。基本原理是：設(shè)計(jì)含一組跨越斷裂點(diǎn)的引物對(duì)樣本DAN進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳。基因缺失時(shí)，片段變小，電泳速率較快；基因插入時(shí)，片段變大，電泳速度較慢。７、 基因點(diǎn)突變的診斷方法有哪些？試述之答：1. 等位基因特異性寡核苷酸分子雜交 等位基因特異性寡核苷酸（ASO, allele specific olignucleotide）分子雜交是檢測(cè)基因點(diǎn)突變的簡(jiǎn)便有效技術(shù)。 其基本原理是： （1）設(shè)計(jì)合成包括突變點(diǎn)在內(nèi)的正常寡核苷酸探針及突變寡核苷酸探針，將這兩種探針進(jìn)行標(biāo)記。 （2）設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物PCR擴(kuò)增，包括突變點(diǎn)在內(nèi)的DNA片段。對(duì)樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 （3）將標(biāo)記的兩種探針分別于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交信號(hào)作用檢測(cè)判斷。由于被檢測(cè)樣品DNA來自PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，故常稱為PCRASO分子雜交2. 反向點(diǎn)雜交（RDB,reverse dot blot） 上述的ASO分子雜交，一次雜交只能檢測(cè)一種點(diǎn)突變，但一種遺傳病的基因點(diǎn)突變常有多種類型的突變，就要進(jìn)行很多次ASO分子雜交過程，這就使得操作過程變得很繁瑣。為此，可采用反向點(diǎn)雜交。 針對(duì)各種基因點(diǎn)突變類型設(shè)計(jì)合成各種探針，同時(shí)合成正常探針，但對(duì)這些各種探針不進(jìn)行標(biāo)記。講所有這些為標(biāo)記的各種突變探針及正常探針分別點(diǎn)樣固定在雜交膜上（固定相，如NC膜）。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做液相（ASO分子雜交時(shí)是固定相），并對(duì)它進(jìn)行標(biāo)記。然后與固定在膜上的各種探針進(jìn)行雜交。這樣，一次檢驗(yàn)就可同時(shí)篩查多重突變，大大提高了基因診斷效率。由于固定相與液相與ASO雜交剛好相反，故稱之為RDB。3. 變性高效液相色譜 上述ASO分子雜交，RDB是用于抑制基因點(diǎn)突變的基因診斷。但有的遺傳病及臨床表型清楚而突變基因及其突變類型不清楚。對(duì)這類疾病的基因診斷稱未知基因突變類型的基因診斷。目前使用的診斷技術(shù)主要是變性高效液相色譜（DHPLC, denature high performance liquid chromatography）。DHPLC的基本原理：（1）HPLC，稱為高效液相色譜。是一種液相柱層析技術(shù)，由于層析時(shí)液體的流動(dòng)相是用高壓泵產(chǎn)生的高壓力液體流動(dòng)，故稱之為高效液相色譜。由于流動(dòng)的液體能使被層析物DNA變性，故DHPLC。（2）若突變位點(diǎn)是正常的，設(shè)計(jì)合成引物PCR擴(kuò)增包括該突變位點(diǎn)在內(nèi)的DNA片段時(shí)。擴(kuò)增的所有DNA片段都是一致的。只產(chǎn)生一種同源的雙鏈DNA。（3）若突變點(diǎn)存在著一場(chǎng)(同時(shí)也存在著正常)，PCR擴(kuò)增的單鏈DNA可隨機(jī)與另一條互補(bǔ)單鏈DNA結(jié)合成雙鏈DNA。這樣就可形成四種雙鏈DNA：兩種同源雙鏈DNA，兩種異源雙鏈DNA。（4）對(duì)這四種雙鏈DNA進(jìn)行DHPLC。由于他們分子結(jié)構(gòu)有差異，帶電荷多少有差異。在液相色譜柱中滯留時(shí)間的長(zhǎng)短就不同，從而出現(xiàn)不同特征洗脫峰。但是，這僅只知道DNA片段是否存在著突變，而不知道突變的位點(diǎn)及性質(zhì)（5）根據(jù)洗脫峰出現(xiàn)的時(shí)間，同源正常、同源異常、二個(gè)異源DNA進(jìn)行DNA測(cè)序分析，用正常做對(duì)照，就檢測(cè)出突變堿基的位點(diǎn)及性質(zhì)。因此，DHPLC需與DNA測(cè)序分析連用，故稱為DHPLC——DNA測(cè)序分析（6）利用DHPLC——DNA測(cè)序分析技術(shù)，能檢測(cè)出未知的基因點(diǎn)突變或發(fā)現(xiàn)新的基因突變類型。目前，這一技術(shù)已形成自動(dòng)化操作分析儀。4. DNA測(cè)序分析 分離出與疾病發(fā)生相關(guān)的基因，DNA測(cè)序確定其堿基順序，并用正常DNA作對(duì)照，就可確定疾病基因的突變位點(diǎn)及突變性質(zhì)。由于PCR技術(shù)及測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，這種分析技術(shù)已成為目前基因診斷中最佳的診斷方法。它主要用于抑制點(diǎn)突變的基因診斷以及產(chǎn)前基因診斷，也可以用于未知基因點(diǎn)突變的基因診斷。８、 基因診斷在遺傳性單基因病中有何應(yīng)用？答：基因診斷技術(shù)可提供最終的確切診斷與常規(guī)的細(xì)胞學(xué)檢查。生化學(xué)檢測(cè)相比，基因診斷耗時(shí)少，準(zhǔn)確性高。此外，單基因并的篩查及產(chǎn)前診斷方面，基因診斷有重要作用。如：新生兒遺傳病篩查、PKV、G6PD缺陷病、β地中海貧血等（P480）。這些疾病也用于產(chǎn)前基因診斷，告知遺傳病受累者做出對(duì)妊娠的選擇。有的單基因診斷能實(shí)現(xiàn)癥狀前檢測(cè)，預(yù)測(cè)個(gè)體發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。９、 基因診斷在多基因遺傳病中有何應(yīng)用？答：多基因遺傳病的發(fā)生時(shí)由于多個(gè)基因突變，加之內(nèi)外環(huán)境因素作用而發(fā)生。此外單獨(dú)測(cè)定某一兩個(gè)基因突變，常常不能對(duì)疾病做出診斷，只能做出基因突變與該種多基因病發(fā)生的相關(guān)性分析。如：腫瘤、糖尿病、高血壓等。如：基因BRCA和BRCA2突變與乳腺癌的發(fā)生有較明顯的相關(guān)性。（通過檢測(cè)基因頻率而做出相關(guān)性分析）。在某些正常人群中，若BRCA或/和BRCA2基因突變頻率較高，可對(duì)這些人群做出乳腺癌發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)性預(yù)測(cè)。此外，糖尿病發(fā)生的相關(guān)基因DQRADQRA2，腫瘤發(fā)生相關(guān)的抑癌基因、癌基因等。都能對(duì)疾病的發(fā)生做出相關(guān)性分析及疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性預(yù)測(cè)。１０、 基因診斷在病原體檢測(cè)中有何應(yīng)用？答：針對(duì)病原體特定的固有保守核酸序列（DNA或RNA）通過PCR或核酸分子雜交技術(shù)確定特殊核苷酸序列存在，從而確定病原體的存在。由于PCR具有高度特異性，高敏感性和快速的特點(diǎn)。只要樣品中有微量的病原體，都可做出診斷。（特別對(duì)難于培養(yǎng)的病原體，如：結(jié)核桿菌、SARS病毒等病原體基因診斷就更具實(shí)用價(jià)值。）有的基因診斷技術(shù)還能做出病原體分型，進(jìn)來對(duì)感染性病原體的耐藥基因，通過基因診斷技術(shù)能做出檢測(cè)。１１、 基因診斷在藥物療效評(píng)價(jià)中有何應(yīng)用？答：基因診斷技術(shù)能對(duì)藥物的療效做出評(píng)價(jià)。如：慢性粒細(xì)胞性白血病（CML），當(dāng)用純化療后是否有效，通過檢測(cè)殘留的白血病細(xì)胞而確定。CML細(xì)胞中含有一種特殊的融合基因ABL/BCR，通過PCR檢測(cè)這個(gè)基因，就可確定有殘留的CML細(xì)胞并可做出定量分析。其敏感性很高，105個(gè)白細(xì)胞中只要有 CML細(xì)胞都能檢測(cè)出來。用藥指導(dǎo)：通過基因診斷能對(duì)用藥進(jìn)行指導(dǎo)。如：氨基糖苷類抗生素有致聾的副作用，其發(fā)生于線粒體DNA 12s rRNA基因的第1555核苷酸A→G突變有關(guān)。因此，對(duì)人群中篩查到第1555位A→G的個(gè)體，應(yīng)避開用這種氨基糖苷類抗生素。又如：藥物轉(zhuǎn)化代謝的加單氧酸，其酶分子中的細(xì)胞色素P450（cy+P450）具有遺傳多態(tài)性，某些種多態(tài)性。藥物的轉(zhuǎn)化快（如麻醉藥）；而另一種多態(tài)性，藥物轉(zhuǎn)化慢。因此，測(cè)定cy+P450遺傳多態(tài)性，能對(duì)個(gè)體的用藥做出預(yù)測(cè)方案。１２、 什么是ＳＴＲ　?。模危林讣y圖？答：STR DNA指紋圖：STR（short tandem repeat）稱短串聯(lián)重復(fù)序列，有24bp組成重復(fù)單位，彼此串聯(lián)而成。如（CA）n、（GC）n等。不同個(gè)體，其重復(fù)次數(shù)不同，整個(gè)STR長(zhǎng)度不同，經(jīng)相應(yīng)內(nèi)切酶酶切后，得到大小不同的片段，經(jīng)電泳分離得到電泳圖稱之為STR圖譜，也稱DNA指紋圖。它表現(xiàn)高度多態(tài)性，除了部分同卵雙生子外，個(gè)體之間都不相同。法醫(yī)學(xué)中用STR DNA指紋圖進(jìn)行犯罪個(gè)體認(rèn)定，親子鑒定。１３、 什么是基因治療？答：用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法將人正?；蚧蛴兄委熥饔玫暮怂崞螌?dǎo)入人體靶細(xì)胞內(nèi)矯正或置換致病基因，是其回復(fù)正常基因結(jié)構(gòu)。或者發(fā)導(dǎo)入的具有治療作用的DNA片段整合到宿主細(xì)胞染色體DNA中或獨(dú)立于染色體外。但DNA片段都能表達(dá)基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)，補(bǔ)償致病基因缺陷所致的功能不足或直接對(duì)疾病有治療作用；或者導(dǎo)入的核酸片段能一直基因過度表達(dá)，或封閉有害基因的表達(dá)。這些用分子生物學(xué)的技術(shù)和原理在核酸水平上對(duì)疾病進(jìn)行治療，稱為基因治療。１４、 基因治療的基本策略有哪些？試述之答：主要有三類：（一）缺陷基因的精確原位修復(fù): 包括基因矯正和基因置換 1. 基因矯正（gene correction）：在染色體上致病基因的原位置處，講突變的堿基給予矯正為正常的堿基，而基因的其他部分仍予保留。 2. 基因置換（gene replacement）:在染色體上致病基因原位置處，用正常基因替換致病基因，是基因完全恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。 這兩種方法都是最理想的治療方法，但目前尚未能再理論上及技術(shù)上得到突破。（二）基因增補(bǔ) 也稱基因添加（gene augmentation）：將正?；?qū)牖颊卟∽兗?xì)胞內(nèi)或相關(guān)細(xì)胞內(nèi)，隨機(jī)整合到染色體DNA中或獨(dú)立于染色體外，不刪除突變的致病基因。導(dǎo)入的正?；虮磉_(dá)的蛋白質(zhì)能補(bǔ)償致病基因缺陷所致的功能不足或直接對(duì)疾病有治療作用。 （當(dāng)然，由于導(dǎo)入基因是隨機(jī)整合，有可能導(dǎo)致原來正常的基因結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而致一種新的疾病的發(fā)生——基因治療的風(fēng)險(xiǎn)性）。（三） 基因沉默或失活 基因沉默（gene silencing）：也稱基因失活（gene inactivation） 向患者體內(nèi)導(dǎo)入核酸物質(zhì)，它能抑制基(siRNA)等，它能使腫瘤細(xì)胞中mRNA降解，阻斷腫瘤細(xì)胞mRNA表達(dá)。從而達(dá)到治療疾病的目的?；蛘咭种萍せ钤┗颍ㄈ鏡as）的過度表達(dá)。１５、 基因治療的基本程序包括哪些？答：可分為五個(gè)步驟： （一） 選擇治療基因 （二） 選擇攜帶治療基因的基因載體并將它與治療基因連接 （三） 選擇基因治療的靶細(xì)胞 （四） 在細(xì)胞水平和整體水平導(dǎo)入治療基因 （五） 治療基因表達(dá)的檢測(cè)。１６、 如何選擇治療基因？答：（一） 治療基因的選擇 引起某種疾病的突變基因是什么，就可用其對(duì)應(yīng)的正?；蚧蛘；蚪?jīng)改造后的基因作為治療基因。如：生長(zhǎng)因子、多肽類激素、受體、酶、轉(zhuǎn)錄因子等的相應(yīng)正?；蚨伎勺鳛橹委熁?。根據(jù)疾病發(fā)生不同，選用不同的基因。１７、 如何選擇攜帶治療基因的載體？答：（二） 選擇攜帶治療基因的載體 治療基因載體能將治療基因攜帶入細(xì)胞內(nèi)，并能阻止細(xì)胞內(nèi)核酸酶對(duì)治療基因的降解，還能進(jìn)一步引導(dǎo)治療基因的表達(dá)。目前，基因治療過程中使用的治療基因載體主要是病毒載體。野生型病毒載體，由于固有的一些缺點(diǎn)不能直接使用，必須經(jīng)過加工改造。將病毒基因組中有感染和致病力的相應(yīng)有害基因剔除，而與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的基因給予保留。１８、 如何選擇基因治療的靶細(xì)胞？答：（三） 選擇基因治療的靶細(xì)胞 基因治療所采用的靶細(xì)胞通常為體細(xì)胞（soma