【正文】 式與 Fe結合 ?因此 Mb與 CO結合力下降 因為 HisE7的存在， O2不能與 Fe以直線排列形式結合 氧合改變 Mb構象 去氧 Mb Fe位于卟啉環(huán)靠近 HisF8一側 卟啉環(huán)圓頂狀向 HisF8凸出 氧合 Mb Fe被拉回到卟啉環(huán)平面 卟啉環(huán)圓頂狀轉為平面 HisF8牽拉 F螺旋 Mb氧結合曲線 —— 肌紅蛋白結合氧的定量分析 K = (1Y)PO2 Y Y = PO2 K+PO2 或 Mb氧結合曲線 Mb的 P50= Torr (即 Pa) 二、血紅蛋白的結構與功能 血紅蛋白 (hemoglobin, Hb)的主要功能是在血液中結合并轉運氧氣，還能運輸 H+和 CO2，存在于血液的紅細胞中。 ?血紅蛋白的結構（ 4個亞基） ?氧合過程中的構象變化 ?Hb的氧結合曲線 ?別構效應 (協(xié)同性 ) （一） Hb的結構 （亞基組成） 人體內(nèi)有正常功能的血紅蛋白 1. 各種亞基由相對應的基因表達生成，三級結構具有相似性 2. 胎兒 HbF之 γ鏈 143位為 Ser（非電離）， β為 His（正電），因此 γ鏈不能和 BPG（負電）結合。 HbF的氧合能力更強，利于從胎盤獲得氧。 Hb的各亞基及 Mb三維結構非常相似 去氧 Hb亞基 Fe位于卟啉環(huán)靠近 HisF8一側 卟啉環(huán)圓頂狀向 HisF8凸出 氧合 Hb亞基 Fe被拉回到卟啉環(huán)平面 卟啉環(huán)圓頂狀轉為平面 HisF8牽拉 F螺旋 T態(tài)（緊張態(tài)） R態(tài)（松馳態(tài)） （二）氧結合引起 Hb構象改變 構象改變 （三） Hb的氧結合曲線 ? Mb的 P50= Torr (即 Pa) ? Hb的 P50=26 Torr (即 Pa) Y = PO2 K+PO2 n n ?n=4 嗎？ ?實際上， n= (1n4) 1Y Y = K n PO2 nH= n PO2 log K log = 1Y Y log Hill方程： 結論： Hb和 O2的結合是高度協(xié)同的，但不完全是“ 全 ” 或 “ 無 ” 的現(xiàn)象 協(xié)同效應，就是增加血紅蛋白在肌肉中的卸 O2效應 （四） Hb的 別構效應 (協(xié)同性 氧合 ) ?血紅蛋白是一種典型的別構蛋白質 ?別構效應 ? 別構部位與配體的結合可影響其他亞基，使這些亞基構象改變，增強或減弱對底物的結合 ?協(xié)同效應 ? 正協(xié)同效應：引起與配體結合能力的增強（激活） ? 負協(xié)同效應：引起與配體結合能力的減弱（抑制） ?血紅蛋白的正協(xié)同效應 ? 一個 O2的結合改變其它亞基的構象，使 Hb從 T態(tài)向 R態(tài)轉化，增強了其他亞基與 O2的結合力 ? Hb的正協(xié)同效應使 Hb既容易和 O2結合，又容易和 O2分離，利于 O2從肺部運輸至組織細胞 ? Hb除能運輸 O2外，還能運輸 CO2和 H+（酸的緩沖） 1. H+和 CO2促進 O2的釋放（ Bohr效應） ? pH的降低使 S曲線右移，即氧合能力降低，促使 O2解離 ? 組織呼吸釋放 CO2， CO2進入紅細胞 H2O+CO2→H 2CO3→H ++HCO3 ? H+促使 HbO2解離，因而有利于從肺向組織運送 O2 ? H+和 CO2結合于 Hb從組織運送到肺部， HCO3從血漿運送至肺 ? 肺部的高氧分壓使 O2與 Hb結合，促使 H+和 CO2解離， H+與 HCO3結合為H2CO3，然后分解為 H2O和 CO2經(jīng)肺排出 ? H+是 Hb氧合的別構抑制劑 ? 碳酸酐酶：紅細胞、肺泡細胞、腎小管細胞 思考： ? Bohr效應的生理學意義？ 提示： ?有利于血紅蛋白釋放 O2 ?緩沖血液 pH值 ? CO2的運輸和釋放 2. BPG降低 Hb對 O2的親和力 ? 去氧 Hb的中央孔穴最大，與 BPG結合力最強。 Hb(O2)4中央孔穴最小，不能與BPG結合。 ? O BPG與 Hb的結合是互相排斥的 ? 組織處 BPG與 Hb的結合有利于 O2的釋放 ? 肺部的氧合過程驅使 BPG離開 Hb ? BPG是 Hb氧合的別構抑制劑 ? BPG是紅細胞無氧氧化的產(chǎn)物 ? BPG與 Hb的結合使曲線右移， ? 無 BPG時肺部結合的O2幾乎不能在組織釋放 ? 海平面處紅細胞中的BPG摩爾數(shù)與 Hb相等，約為 ，從肺部運送到組織的 O2約38%被釋放 ? 進入海拔 4500m時，組織獲得的 O2降至 30% ? 2天后 BPG增加到，組織獲得的 O2升高至 37% 思考： ? 解釋高原適應性的機理？ 提示： ? BPG降低 Hb對 O2的親和力 B Z S G H T A R P Y V M I L F K 5 15 20 25 30 35 10 吸光度 洗脫時間／ min PTC氨基酸混合物 HPLC的洗脫圖 其中一種氨基酸分析方法是： ? 酸水解后，用苯異硫氰酸酯 (PITC)處理蛋白質水解液(pH 9)，生成苯硫脲 (PTC)氨基酸衍生物，經(jīng) HPLC按疏水特性分離， 254nm處測光吸收，確定其濃度。 Asp或Asn Asp或 Asn Trp (W) ？ 堿水解確定 甲基磺酸代替鹽酸水解蛋白 三、 Edman降解 ? 由 Edman于 1950年公布的一項新的氨基酸序列的測定技術 —— Edman降解法（ 苯異硫氰酸酯法 ，即 PITC法 ） ?為 α NH2的反應，用于 N末端分析。 ? Edman降解測序主要涉及耦聯(lián)、水解、萃取和轉換等 4個過程。 NCO C HN HSCR 1苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物 (PTH氨基酸 ) NHS :CC H COR 1H N N H C H COR 2苯氨基硫甲酰肽 (PTC肽 ) SNHCN H OCR 1C H噻唑啉酮苯胺 (ATZ) N H 2 C H COR 2 減少一個殘基的肽 N C SPITC N H C H COR 2N C H COR 1HH肽 + F3CCOOH 恢復堿性條件，進入下一次 Edman循環(huán) 經(jīng)色譜鑒定氨基酸的種類 酸性水溶液 二硫橋的斷裂： ? 甲酸氧化法和巰基化合物還原法。 四、多肽裂解與序列確定 ? Edman降解法通常測定的多肽長度在 40個殘基以內(nèi)，因此，測定大的蛋白質氨基酸序列需要將其降解為一些肽段，然后分別對這些肽段進行 Edman降解測序。 ? 蛋白質降解常用的是一些 水解酶 和 化學試劑 。 ? 常用蛋白水解酶： 胰蛋白酶 （ trypsin，斷裂以Arg和 Lys為 C末端殘基的肽段）和 胰凝乳蛋白酶（ chymotrypsin，斷裂 Phe、 Trp和 Tyr等疏水氨基酸殘基的羧基端肽鍵） H3NGlyArgAlaSerPheGlyAsnLysTrpGluValCOO + H3NGlyArgCOO + H3NAlaSerPheGlyAsnLysCOO + H3NTrpGluValCOO + + + H3NGlyArgAlaSerPheCOO + H3NGlyAsnLysTrpCOO + H3NGluValCOO + + + H3NGlyArgAlaSerPheGlyAsnLysTrpGluValCOO + (a) (b) (c) 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 GlyArg AlaSerPheGlyAsnLys TrpGluVal GlyArgAlaSerPhe GlyAsnLysTrp GluVal 兩種蛋白酶的水解部位和蛋白序列的確定 肽的化學合成 多肽化學合成： ?液相合成 ?固相合成 一、液相合成 多肽合成的基本過程是 20世紀初由 Emil Fischer設計的，稱為液相合成法： ? 合成方向 N端 → C端 ? 二肽合成如右圖 二、固相合成 1962年 R. Bruce Merrifield在多肽合成技術方面取得突破性進展： R. Bruce Merrifield ? 合成方向 C端 → N端 ? 二肽合成如圖 二環(huán)已基碳二亞胺 固相載體 掛接 去保護 第一個氨基酸（氨基被保護） 第二個氨基酸（氨基被保護） 二環(huán)已基脲 縮合 去保護和斷裂 固相合成的優(yōu)點： ?固相合成反應物和產(chǎn)物都連接在固相載體上，可在一個反應容器中進行所有的反應，便于自動化操作。 ?固相合成加入過量的反應物可獲得高產(chǎn)率的產(chǎn)物，同時產(chǎn)物很容易分離。 ? 非極性脂肪族氨基酸 ? 極性中性氨基酸 ? 芳香族氨基酸 ? 酸性氨基酸 ? 堿性氨基酸 二、氨基酸 可根據(jù)側鏈結構和理化性質進行分類 (一 )側鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族氨基酸 (二 )側鏈有極性但不帶電荷的氨基酸是極性中性氨基酸 (三 )側鏈含芳香基團的氨基酸是芳香族氨基酸 (四 )側鏈含負性解離基團的氨基酸是酸性氨基酸 (五 )側鏈含正性解離基團的氨基酸屬于堿性氨基酸 ? 幾種特殊氨基酸 ? 脯氨酸 （亞氨基酸） CH 2 CHCOO NH 2 + CH 2 CH 2 ? 半胱氨酸 + ?胱氨酸 二硫鍵 HH OOC CH CH 2 S + NH 3 S CH 2 CH COO + NH 3 OOC CH CH 2 SH + NH 3 HS CH 2 CH COO + NH 3