生物化學(xué)合工大第四章核酸化學(xué)-資料下載頁(yè)
2025-01-16 12:49本頁(yè)面
【正文】 ，在緩慢冷卻的條件 下可重新結(jié)合恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為退 火。 ，一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)， 但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。 DNA的復(fù)性圖示 DNA驟然冷卻至低溫 時(shí) ， DNA不可能復(fù)性 。 即淬火 。 DNA緩慢冷卻時(shí) ， 可以復(fù) 性 。 退火溫度＝ Tm－ 25℃ 。 濃度越大 ， 復(fù)性越容易 。 此外 ， DNA的復(fù)性需要 一定的鹽濃度 ， 也與它本身的組成和 結(jié)構(gòu)有關(guān) 。 高于 Tm值 5℃ 復(fù)性 也稱退火 3. 影響復(fù)性的因素 ① 樣品的性質(zhì) ② DNA的濃度 ③ DNA片段的大小 ④ 溫度 ⑤ 離子強(qiáng)度 DNA的復(fù)性過(guò)程是一種雙分子反應(yīng) DSS k? ????S： single strand DNA D： double strand DNA 21CC0?Cot : 21 時(shí)的 Cot值，即指復(fù)性完成一半時(shí)的 Cot值。 DNA溶液中加入外源 DNA單鏈分子或 RNA單鏈分子（與原 DNA具有同源性），去掉變 性條件后復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的過(guò)程。 DNA分子。 究同源性等。 分子雜交 探針： 用于雜交的異源 DNA或RNA序列，其核苷酸序列是人工特定的、已知的，經(jīng)放射性標(biāo)記的一條鏈。 核酸 的變性、復(fù)性和雜交 變性 （加熱） 探針 雜交 （緩慢冷卻） 復(fù)性 （緩慢冷卻） 分子雜交的種類 1) Southern Blot： DNADNA雜交 2) Northern Blot： DNARNA雜交 3) Western Blot：抗原 抗體進(jìn)行雜交 4) 原位雜交：活體組織上進(jìn)行雜交，顯出熒光 Southern印跡法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 瓊脂糖電泳 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 與放射性標(biāo)記DNA探針雜交 放射自顯影 帶有 DNA片段的凝膠 凝膠 濾膜 用緩沖液轉(zhuǎn)移 DNA 吸附有 DNA片段的膜 第五節(jié) 核酸的研究方法 一、核酸的分離、提取通則 為了得到完整的大分子核酸，一般要注意 3點(diǎn) ： 1．保持低溫（ 0186?！?4℃ ）。 2．防止過(guò)酸、過(guò)堿，避免劇烈攪拌。 3．防止核酸酶的作用。 抑制 DNase： 可加檸檬酸鈉、 EDTA等金屬螯合劑；或加去污劑 十二烷基硫酸鈉（ SDS）；或加蛋白變性劑。 抑制 RNase： （ 1）實(shí)驗(yàn)器皿高溫，或高壓滅菌，不能高壓滅菌的用 具用 %二乙基焦碳酸鹽（ diethyl pyrocarbonate, DEPC）處理。 （ 2）加強(qiáng)的蛋白變性劑如硫氰酸胍、異硫氰酸胍等。 （ 3）加核糖核酸酶阻抑蛋白（ RNasin）等 RNase的抑制劑。 二、大分子 DNA的提取 1．材料的選擇 2．細(xì)胞破碎 3． DNA蛋白質(zhì)（ DNP）的提取 真核細(xì)胞 DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白（ DNP）， RNA與蛋白質(zhì)結(jié)合成 RNP，而且 DNP和RNP常?；煸谝黄稹＠?DNP和RNP在不同濃度 NaCl中溶解度的不同來(lái)分離 DNP和 RNP。 可用 1mol/LNaCl溶液提取 DNP。 012 0 .1 4相 對(duì) 溶 解 度 NaCl（ mol/L） DNP在 NaCl中的溶解度 4．去蛋白質(zhì) （ 1） SDS （ 2）苯酚法 （ 3）氯仿法 （ 4）酚 :氯仿 :異戊醇 ＝ 25:24:1 5．沉淀 DNA 6．去雜質(zhì) （ 1）去 RNA （ 2）去多糖 7．進(jìn)一步純化 生物材料 DNP（ RNP） DNP 纖維狀 DNA 較純 DNA 純 DNA *原核生物的 DNA是裸露的，與蛋白質(zhì)結(jié)合不多，分離純化要簡(jiǎn)單些。 破細(xì)胞 * 去蛋白質(zhì) 酒精沉淀 去 RNA 柱層析，電泳 密度梯度離心 去多糖 三、 RNA的提取 1．不同種類 RNA的提取 2．大分子 RNA的提取 （ 1）酚提取 （ 2）酚 氯仿 SDS法 3． mRNA的提取 四、核酸純度鑒定 五、核酸含量的測(cè)定 本章重點(diǎn) : 1. 核酸的化學(xué)本質(zhì)、結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的基本特征
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