生物化學(xué)第二章核酸化學(xué)2性質(zhì)研究方法-資料下載頁
2025-01-16 13:52本頁面
【正文】 或地衣酚 ） 反應(yīng)生成綠色化合物 ， 該化合物可在 670680nm波長下進(jìn)行比色測定 。 DNA的測定： DNA分子中的脫氧核糖在冰醋酸或濃硫酸存在下可與二苯胺反應(yīng)生成蘭色化合物 ， 該化合物可在595620nm波長下進(jìn)行比色測定 。 定磷法 RNA和 DNA中都含有磷酸 ， 可以進(jìn)行磷的測定 。 純的核酸中含磷量在 %左右 ， 因此 ， 測出核酸中的磷含量就可計算核酸的含量 。 測定時先將核酸用強(qiáng)酸消化成無機(jī)磷酸 ， 后者與定磷試劑中的鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸 ， 在經(jīng)過還原作用而生成藍(lán)色的復(fù)合物 ， 最后在 650660nm進(jìn)行比色測定 。 四．核酸研究方法 （一）核酸的沉降特性 溶液中的核酸在引力場中可以下沉 。 在超速離心機(jī)造成的強(qiáng)大的離心力場中 ， 核酸分子下沉的速度大大加快 。核酸的超速離心用于： 測定核酸的浮力密度； 測定 DNA分子中的 G、 C含量； 測定溶液中核酸的構(gòu)象，核酸經(jīng)染料 — 氯化銫密度梯度離心以后，在離心管里，沉降的速度由大到小依次為：超螺旋 DNA、 閉環(huán)質(zhì)粒 DNA、 開環(huán)及線型 DNA， 若樣品中含有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)沉降速度最小。 核酸的制備。 （二）核酸的凝膠電泳 凝膠電泳是當(dāng)前核酸研究中最常用的方法 ，有瓊脂糖凝膠電泳 、 聚丙烯酰胺凝膠電泳 。 前者常用于 DNA的分離分析 ， 后者用于 RNA的分離分析 。 五、核酸的序列測定 DNA的一級結(jié)構(gòu)的測定方法 (酶法測序） DNA的合成總是從 5′ 端向 3′ 端進(jìn)行的。 DNA的合成需要模板以及相應(yīng)的引物鏈。 DNA的合成過程中，在合成的 DNA鏈的 3′ 末端，依據(jù)堿基配對的原則，通過生成新的 3′,5′ －磷酸二酯鍵，使 DNA鏈合成終止，產(chǎn)生短的 DNA鏈。具體測序工作中，平行進(jìn)行四組反應(yīng)，每組反應(yīng)均使用相同的模板，相同的引物以及四種脫氧核苷酸；并在四組反應(yīng)中各加入適量的四種之一的雙脫氧核苷酸，使其隨機(jī)地接入 DNA鏈中，使鏈合成終止，產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長度的、不同長短的 DNA鏈。這四組 DNA鏈再經(jīng)過聚丙烯酸胺凝膠電泳按鏈的長短分離開，經(jīng)過放射自顯影顯示區(qū)帶，就可以直接讀出被測 DNA的核苷酸序列 , 2. Maxam Gilbert DNA (1)先將 DNA的末端之一進(jìn)行標(biāo)記 (通常為放射性同位素 32P； (2)在多組互相獨立的化學(xué)反應(yīng)中分別進(jìn)行特定堿基的化學(xué)修飾； (3)在修飾堿基位置化學(xué)法斷開 DNA鏈； (4)聚丙烯酰胺凝膠電泳將 DNA鏈按長短分開； (5)根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出 DNA的核苷酸序列 ,如下圖所示： 這一方法的基本步驟為 : 化學(xué)裂解法測定 DNA的核苷酸序列 六、 PCR基本原理 167。 核酸的理化性質(zhì) 167。 核酸的分離純化 、 測定及研究方法
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