王鏡巖生物化學(xué)經(jīng)典課件5核酸化學(xué)考研必備學(xué)生物化學(xué)必備-資料下載頁(yè)
2025-01-16 09:39本頁(yè)面
【正文】 的標(biāo)記位點(diǎn)。 常用遺傳圖、轉(zhuǎn)錄圖、物理圖、序列標(biāo)簽位點(diǎn) (STS)、表達(dá)序列標(biāo)簽 (EST)等方法確定標(biāo)記位點(diǎn)。 限制性酶切位點(diǎn)分析是繪制物理圖的常用方法 (三 ) RNA的測(cè)序 4種特異性的酶切割（從胰臟提取的 RNase A水解嘧啶核苷酸的磷酸二酯鍵，米曲霉中提取的 RNase T1水解鳥(niǎo)苷酸的磷酸二酯鍵，黑粉曲霉中提取的 RNase U2水解腺苷酸的磷酸二酯鍵，多頭黏菌中提取的 RNase Phy Ι 水解 A、 U、 G三種核苷酸的磷酸二酯鍵） ,凝膠電泳分離，用類似蛋白質(zhì)序列分析的方法推斷核苷酸序列。 RNA鏈，用類似 DNA化學(xué)測(cè)序的方法推斷核苷酸序列。 cDNA，用 DNA測(cè)序的方法推斷核苷酸序列。 （四）聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR） 原理 PCR (polymerase chain reaction)是應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)技術(shù)之一，模板 DNA的含量依 指數(shù)方式增加，可用來(lái)快速在體外擴(kuò)增 DNA, PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)和分子生物學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛。耐熱 DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用。 PCR 典型的 PCR經(jīng)過(guò)一定的調(diào)整可用于特殊的研究工作，使 PCR技術(shù)擴(kuò)展到分子生物學(xué)的各個(gè)方面，較常用的技術(shù)擴(kuò)展有： 1. “巢式” PCR(nested PCR) 先用一對(duì)引物對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后再用另一對(duì)引物擴(kuò)增第一對(duì)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物，這一 PCR 技術(shù)即巢式 PCR。第一次擴(kuò)增所用引物稱 外引物 (outerprimer)，第二次擴(kuò)增作用的引物稱 內(nèi)引物 (interprimer)。 進(jìn)行 “ 巢式 ” PCR可將 外引物設(shè)計(jì)得比內(nèi)引物長(zhǎng)一些，且用量較少 ，用外引物進(jìn)行時(shí)，采用 較高退火溫度使內(nèi)引物不能與模板結(jié)合 ，故只有外引物擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)若干循環(huán)，待外引物基本消耗完畢后，只需降低退火溫度即可直接進(jìn)行內(nèi)引物的 PCR擴(kuò)增。這種 PCR技術(shù)被稱為 “ 中途進(jìn)退式 ” PCR(dropindropout PCR) “ 巢式 ” 及 “ 中途進(jìn)退式 ” PCR主要用于 極少量模板 的擴(kuò)增。 2. 復(fù)合 PCR(multiplex PCR) 在同一反應(yīng)中用 多組引物同時(shí)擴(kuò)增幾種基因片段 的方法稱復(fù)合 PCR。復(fù)合 PCR主要用于同一病原體分型及同時(shí)檢測(cè)多種病原體。此外也常用于多點(diǎn)突變性分子病的診斷。 3. 不對(duì)稱 PCR(asymmetric PCR) 兩種引物比例相差較大 的 PCR稱不對(duì)稱 PCR。不對(duì)稱 PCR可制備用于核酸序列分析的單鏈 DNA片段或核酸雜交的探針等。 4. 反轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse transcription PCR) 由于 Taq酶只能以 DNA為模板，當(dāng)待擴(kuò)增模板為 RNA時(shí)，需先將其 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA才能進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 ，這種 PCR技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR 5. 涂片 PCR(slidePCR) 直接對(duì)載玻片上 細(xì)胞涂片或組織切片進(jìn)行 PCR擴(kuò)增的方法稱涂片 PCR。涂片 PCR結(jié)合原位雜交技術(shù)特別適用于病理切片中含量較少的靶序列的 PCR檢測(cè)。 6. 反向 PCR(inverse PCR) 擴(kuò)增引物相反方向 DNA序列的 PCR技術(shù)稱反向 PCR。在反向 PCR中，要先將含有一段已知序列的感興趣的未知 DNA片段進(jìn)行 酶切和環(huán)化 ，然后直接進(jìn)行 PCR，也可將已知序列酶切后再進(jìn)行 PCR。反向 PCR主要用于 已知序列兩翼未知 DNA序列的擴(kuò)增。 7. 錨定 PCR(anchored PCR) 用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 3′ 端加上一段已知序列 ，然后以此序列 為引物結(jié)合位點(diǎn)對(duì)該 cDNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增稱為錨定 PCR，可用于未知 cDNA的制備及低豐度 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 。 8. 修飾引物 PCR 為達(dá)到某些特殊應(yīng)用目的如 定向克隆、定點(diǎn)突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析 等，可在引物的 5′ 末端加上酶切位點(diǎn)、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子及序列分析物結(jié)合位點(diǎn)等，這種 PCR技術(shù)稱為修飾引物 PCR。此外，還可將一些信號(hào)分子如熒光素、生物素等連接于引物的 5′ 末端，當(dāng) PCR完成后可對(duì)產(chǎn)物直接進(jìn) PCR在生命科學(xué)中的應(yīng)用非常廣泛，已有不少專著可供讀者參考。 （五） DNA的化學(xué)合成 固相磷酰亞胺法合成時(shí)，末端核苷酸的 3′ OH與固相載體成共價(jià)鍵， 5′ OH被 4， 4′ 二甲氧基三苯甲基(DMTr)保護(hù)，下一個(gè)核苷酸的5′ OH亦被 DMTr保護(hù)， 3′ OH上的磷酸基上有 N(C3H7)2和 OCH3兩個(gè)基團(tuán)， 3′ OH因此被活化。 每延伸一個(gè)核苷酸需四步化學(xué)反應(yīng)： (1) 脫三苯甲基：末端核苷酸的 DMTr用三氯乙酸 /二氯甲烷溶液脫去，游離出 5′ OH 。 (2) 縮合：新生成的 5′ OH 在四唑催化下與下一個(gè)核苷 3′ 磷酰亞胺單體縮合使鏈增長(zhǎng)。 (3) 蓋帽：有少量 (小于 %)未縮合的5′ OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙?；忾]，以防進(jìn)一步縮合造成錯(cuò)誤延伸。 (4) 氧化：新增核苷酸鏈中的磷為三價(jià)亞磷，需用碘氧化成五價(jià)磷。上述步驟循環(huán)一次，核苷酸鏈向 5′ 方向延伸一個(gè)核苷酸。 基本要求 、提純、定量測(cè)定、超速離心和凝膠電泳等基本方法。 （重點(diǎn)） 。 （難點(diǎn)） DNA聚合酶鏈反應(yīng)的原理及應(yīng)用。 （難點(diǎn)） DNA化學(xué)合成的原理及應(yīng)用。 （難點(diǎn)）
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