王鏡巖生物化學(xué)經(jīng)典課件5核酸化學(xué)考研必備學(xué)生物化學(xué)必備-資料下載頁
2025-01-16 09:39本頁面
【正文】 的標記位點。 常用遺傳圖、轉(zhuǎn)錄圖、物理圖、序列標簽位點 (STS)、表達序列標簽 (EST)等方法確定標記位點。 限制性酶切位點分析是繪制物理圖的常用方法 (三 ) RNA的測序 4種特異性的酶切割（從胰臟提取的 RNase A水解嘧啶核苷酸的磷酸二酯鍵，米曲霉中提取的 RNase T1水解鳥苷酸的磷酸二酯鍵，黑粉曲霉中提取的 RNase U2水解腺苷酸的磷酸二酯鍵，多頭黏菌中提取的 RNase Phy Ι 水解 A、 U、 G三種核苷酸的磷酸二酯鍵） ,凝膠電泳分離，用類似蛋白質(zhì)序列分析的方法推斷核苷酸序列。 RNA鏈，用類似 DNA化學(xué)測序的方法推斷核苷酸序列。 cDNA，用 DNA測序的方法推斷核苷酸序列。 （四）聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR） 原理 PCR (polymerase chain reaction)是應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)技術(shù)之一，模板 DNA的含量依 指數(shù)方式增加，可用來快速在體外擴增 DNA, PCR技術(shù)在臨床檢驗和分子生物學(xué)中的應(yīng)用十分廣泛。耐熱 DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)推動了這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用。 PCR 典型的 PCR經(jīng)過一定的調(diào)整可用于特殊的研究工作，使 PCR技術(shù)擴展到分子生物學(xué)的各個方面，較常用的技術(shù)擴展有： 1. “巢式” PCR(nested PCR) 先用一對引物對模板進行擴增，然后再用另一對引物擴增第一對引物擴增的產(chǎn)物，這一 PCR 技術(shù)即巢式 PCR。第一次擴增所用引物稱 外引物 (outerprimer)，第二次擴增作用的引物稱 內(nèi)引物 (interprimer)。 進行 “ 巢式 ” PCR可將 外引物設(shè)計得比內(nèi)引物長一些，且用量較少 ，用外引物進行時，采用 較高退火溫度使內(nèi)引物不能與模板結(jié)合 ，故只有外引物擴增。經(jīng)過若干循環(huán)，待外引物基本消耗完畢后，只需降低退火溫度即可直接進行內(nèi)引物的 PCR擴增。這種 PCR技術(shù)被稱為 “ 中途進退式 ” PCR(dropindropout PCR) “ 巢式 ” 及 “ 中途進退式 ” PCR主要用于 極少量模板 的擴增。 2. 復(fù)合 PCR(multiplex PCR) 在同一反應(yīng)中用 多組引物同時擴增幾種基因片段 的方法稱復(fù)合 PCR。復(fù)合 PCR主要用于同一病原體分型及同時檢測多種病原體。此外也常用于多點突變性分子病的診斷。 3. 不對稱 PCR(asymmetric PCR) 兩種引物比例相差較大 的 PCR稱不對稱 PCR。不對稱 PCR可制備用于核酸序列分析的單鏈 DNA片段或核酸雜交的探針等。 4. 反轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse transcription PCR) 由于 Taq酶只能以 DNA為模板，當(dāng)待擴增模板為 RNA時，需先將其 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA才能進行 PCR擴增 ，這種 PCR技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄PCR 5. 涂片 PCR(slidePCR) 直接對載玻片上 細胞涂片或組織切片進行 PCR擴增的方法稱涂片 PCR。涂片 PCR結(jié)合原位雜交技術(shù)特別適用于病理切片中含量較少的靶序列的 PCR檢測。 6. 反向 PCR(inverse PCR) 擴增引物相反方向 DNA序列的 PCR技術(shù)稱反向 PCR。在反向 PCR中，要先將含有一段已知序列的感興趣的未知 DNA片段進行 酶切和環(huán)化 ，然后直接進行 PCR，也可將已知序列酶切后再進行 PCR。反向 PCR主要用于 已知序列兩翼未知 DNA序列的擴增。 7. 錨定 PCR(anchored PCR) 用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 3′ 端加上一段已知序列 ，然后以此序列 為引物結(jié)合位點對該 cDNA進行 PCR擴增稱為錨定 PCR，可用于未知 cDNA的制備及低豐度 cDNA文庫的構(gòu)建 。 8. 修飾引物 PCR 為達到某些特殊應(yīng)用目的如 定向克隆、定點突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析 等，可在引物的 5′ 末端加上酶切位點、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動子及序列分析物結(jié)合位點等，這種 PCR技術(shù)稱為修飾引物 PCR。此外，還可將一些信號分子如熒光素、生物素等連接于引物的 5′ 末端，當(dāng) PCR完成后可對產(chǎn)物直接進 PCR在生命科學(xué)中的應(yīng)用非常廣泛，已有不少專著可供讀者參考。 （五） DNA的化學(xué)合成 固相磷酰亞胺法合成時，末端核苷酸的 3′ OH與固相載體成共價鍵， 5′ OH被 4， 4′ 二甲氧基三苯甲基(DMTr)保護，下一個核苷酸的5′ OH亦被 DMTr保護， 3′ OH上的磷酸基上有 N(C3H7)2和 OCH3兩個基團， 3′ OH因此被活化。 每延伸一個核苷酸需四步化學(xué)反應(yīng)： (1) 脫三苯甲基：末端核苷酸的 DMTr用三氯乙酸 /二氯甲烷溶液脫去，游離出 5′ OH 。 (2) 縮合：新生成的 5′ OH 在四唑催化下與下一個核苷 3′ 磷酰亞胺單體縮合使鏈增長。 (3) 蓋帽：有少量 (小于 %)未縮合的5′ OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙?；忾]，以防進一步縮合造成錯誤延伸。 (4) 氧化：新增核苷酸鏈中的磷為三價亞磷，需用碘氧化成五價磷。上述步驟循環(huán)一次，核苷酸鏈向 5′ 方向延伸一個核苷酸。 基本要求 、提純、定量測定、超速離心和凝膠電泳等基本方法。 （重點） 。 （難點） DNA聚合酶鏈反應(yīng)的原理及應(yīng)用。 （難點） DNA化學(xué)合成的原理及應(yīng)用。 （難點）
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