【正文】 P濃度可根據(jù)特定靶序列長度和堿基組成來確定。 ?四種 dNTP的濃度應(yīng)相同。 ?dNTP溶液具有較強的酸性，通常把 dNTP配成5~10mmol/L貯存液，用 NaOH調(diào) pH至中性，分裝后 20℃ 凍存 。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 96 4） Taq DNA聚合酶 ? 最早用于 PCR反應(yīng)的酶是 Klenow酶 ? 缺點：熱穩(wěn)定性差；酶反應(yīng)溫度偏低。 ? 1988年 Saiki 用 Taq DNA聚合酶 （代替 Klenow酶）， 具有良好的熱穩(wěn)定性 。該酶存在于水生嗜熱細(xì)菌 (Thermus aquaticus)內(nèi)，可在 74℃ 復(fù)制DNA，在 95℃ 仍具有聚合酶活力。 ? 濃度： 。 ? 目前主要有兩種 Taq DNA聚合酶供應(yīng)：從棲熱水生桿菌中提純的天然酶、大腸桿菌合成的基因工程酶 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 97 5）擴增反應(yīng)緩沖液 ? 最為常用的緩沖體系是 10~50mmol/L TrisHCl(~， 20℃ )。 ? 反應(yīng)混合物中 50mmol/L以內(nèi)的 KCl有利于引物退火。 ? 小牛血清白蛋白 (100μg/ml)或明膠 (%)或Tween 20(%%)有助于 Taq DNA聚合酶的穩(wěn)定。 ? 在反應(yīng)體系中加入適量（ 10%）二甲亞砜（ DMSO）可減少模板二級結(jié)構(gòu)，提高 PCR反應(yīng)特異性。 ? Mg2+的作用：為 DNA聚合酶活性所必需。 Mg2+的濃度：一般為 ~。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 98 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 99 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 100 五、 DNA的重組技術(shù) 重組 DNA技術(shù)的相關(guān)概念 ? DNA重組（ DNA克?。? ? 克隆（ clone） 無性繁殖 ? 分子克隆 (DNA克隆 )應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將目的基因與載體 DNA結(jié)合成具有自我復(fù)制能力的 DNA分子（復(fù)制子、重組體），繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴增、提取獲得大量同一 DNA分子拷貝，或其表達(dá)產(chǎn)物。 ? 基因克隆、 DNA重組、 ? 基因工程 (geic engineering) 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 101 基因重組的基本過程 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 102 ? （一）目的基因的制備 ? （ 1）從生物基因組 DNA中分離目的基因 ? （ 2）反轉(zhuǎn)錄法 :是先分離純化目的基因的 mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后進(jìn)行 cDNA的克隆表達(dá)。 ? （ 3）人工合成法 :人工合成目的基因 DNA片段有化學(xué)合成和酶促合成法兩條途徑。 ? （ 4） PCR反應(yīng)合成 DNA DNA重組的基本過程 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 103 ? (二 )選擇適當(dāng)?shù)妮d體 ? 外源基因（ DNA片段）很難直接透過受體細(xì)胞的細(xì)胞膜進(jìn)入受體細(xì)胞，即使進(jìn)入也會受到細(xì)胞內(nèi)限制性酶的作用而分解。要將外源 DNA片段導(dǎo)入受體細(xì)胞，必須選擇適當(dāng)?shù)妮d體。 ? 通常在基因工程中選作載體的有： ? ①質(zhì)粒 —— 環(huán)狀雙鏈小型 DNA分子 ； ? ②噬菌體 —— 常用的是 λ 噬菌體； ? ③病毒 —— 例如牛痘病毒、腺病毒常用作動物細(xì)胞基因工程的載體。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 104 ? （三）體外重組（外源基因連接） ? 含有目的基因的 DNA片段和載體 DNA連接技術(shù)即 DNA重組技術(shù)。 ? 把目的基因連接到載體上去，要經(jīng)過一系列酶促反應(yīng)，需要多種工具酶，最為重要的兩類酶是： ? ① DNA限制性內(nèi)切酶 把載體 DNA片段切開。 ? ② DNA連接酶 用于連接載體和外源 DNA片段。 ? 此外，在構(gòu)建 DNA重組分子中使用的工具酶還有：DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、 DNA修飾酶、 RNA修飾酶、核酸外切酶、堿性磷酸酶等。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 105 （四）重組 DNA片段導(dǎo)入受體細(xì)胞 ? 重組體 DNA分子只有導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞，才能進(jìn)行大量地復(fù)制，擴增和表達(dá)。 ? 受體細(xì)胞有多種 ，第一類是 原核細(xì)胞 ，目前常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等。如胰島素基因工程生產(chǎn)就是將外源 DNA導(dǎo)入原核細(xì)胞大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)實現(xiàn)的。第二類是 真核細(xì)胞 ，常用的有酵母菌、絲狀真菌、植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞等。 ? 使用一系列技術(shù)方法幫助細(xì)胞接受外源 DNA。包括：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、感染、轉(zhuǎn)導(dǎo)和顯微注射、應(yīng)用脂質(zhì)體或電穿孔等。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 106 （五） 重組 DAN的篩選 ? 接受重組 DNA的宿主細(xì)胞中間只有一小部分是真正含有所需要的基因的。 ? 一般通過 3種方法可以取得所需要的宿主細(xì)胞： ? ①遺傳學(xué)方法，對于帶有抗藥性基因的質(zhì)粒來講，從被轉(zhuǎn)化細(xì)菌是否由敏感狀態(tài)變?yōu)榭顾幍臓顟B(tài)就可以知道它有沒有獲得這一抗藥性質(zhì)粒。一個抗藥性基因中間如果接上了一段外來的 DNA片段，就使獲得這一質(zhì)粒的細(xì)菌不再表現(xiàn)抗性。 ? ②免疫學(xué)方法③分子雜交方法，當(dāng)一個宿主細(xì)胞獲得了攜帶在載體上的基因后，細(xì)胞中往往就出現(xiàn)這一基因所編碼的蛋白質(zhì)，用免疫學(xué)方法可以檢出這種細(xì)胞。分子雜交的原理和方法同樣可以用來檢測這一基因的存在。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 107 （六）克隆基因的表達(dá) ? 克隆基因表達(dá)就是使之在宿主細(xì)胞中獲取大量具有特定生物活性的蛋白質(zhì) 。 ? 克隆的基因只有通過表達(dá)才能獲得具有特定生物活性的蛋白質(zhì)，在醫(yī)學(xué)上、以至在工業(yè)上才能具有應(yīng)用價值。 ? 發(fā)酵工程：采用現(xiàn)代工程技術(shù)手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，或直接把微生物應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)過程的一種新技術(shù)。發(fā)酵工程的內(nèi)容包括菌種的選育、培養(yǎng)基的配制、滅菌、擴大培養(yǎng)和接種、發(fā)酵過程（控制溫度、PH、生化指標(biāo)等）和 產(chǎn)品的分離提純 等方面。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 108 PCR在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用（選學(xué)） ? 目的：個體識別 ? 親子鑒定 ? 性別鑒定 ? 1985年，英國遺傳學(xué)家 Jeffreys制備出DNA指紋圖（ DNA fingerprint），其本質(zhì)為具有個體特異性的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)圖譜（ RFLP）。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 109 ? DNA鑒定 ? 每個人體細(xì)胞有 23對（ 46條）成對的染色體，分別來自父親和母親。約有 30億個核苷酸構(gòu)成整個染色體系統(tǒng)，沒有任何兩個人具有完全相同的核苷酸序列，這就是人的遺傳多態(tài)性。 ? 由于 DNA 指紋提供了豐富的個體特異性遺傳標(biāo)記，因而在法醫(yī)學(xué)鑒定中具有重要意義。其主要應(yīng)用有以下幾個方面： 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 110 ? 在刑事案件中的應(yīng)用 在法醫(yī)學(xué)上，如果確定某人是嫌疑犯，則可提取其血樣或毛發(fā)的 DNA，做出 DNA指紋，然后由犯罪現(xiàn)場殘留的血、精液、唾液、痰液、毛發(fā)、骨骼或其他肉體成分提取的 DNA指紋相對照。若兩者一樣，則稱其指紋相配，證明該嫌疑犯就是作案的罪犯，反之則否。 ? 在親子鑒定中的應(yīng)用 ? 空難、爆炸、火災(zāi)等 災(zāi)害事故受難者殘骸鑒定 ? 人種、性別鑒定 ? 在食品科學(xué)中 的應(yīng)用一些化學(xué)方法無法鑒別性質(zhì)非常相近的成分（如橄欖油和榛木榛木油） , 轉(zhuǎn)基因食用油。 2022/8/22 ZhangJGBiochemistry 111 ? 第四章作業(yè) ? P132 第 7 題 ? 補充題 簡述基因工程（ DNA重組）的基本過程。 ? 補充題 名詞解釋： 基因、 限制性核酸內(nèi)切酶 、 DNA解鏈溫度（ Tm ）、 核酸分子雜交、 PCR技術(shù) ? 補充題 下列關(guān)于雙鏈 DNA堿基摩爾含量的關(guān)系式那一項是錯誤的？ ? ① A=T、 G=C ② A+T=G+C ? ③ A+G=C+T ④ A+C=G+T