【正文】 ab 4－ ab+ 原生質(zhì)體的形成 融合 CW再生 穩(wěn)定 正變株的篩選 細(xì)胞原生質(zhì)體融合程序示意圖 （一）標(biāo)記菌株的篩選 在原生質(zhì)體融合過程中，為了便于篩選，通常對于所用的 親株 都要進(jìn)行一定的遺傳標(biāo)記。 一般可以采用 營養(yǎng)缺陷標(biāo)記 和 抗藥性標(biāo)記 。 （二）原生質(zhì)體的制備 在細(xì)菌和放線菌中主要采用溶菌酶 ； 在酵母菌和霉菌中一般可用蝸牛酶和纖維素酶。 影響原生質(zhì)體制備的因素 菌體的預(yù)處理 為了使酶的作用效果更好一些，可對菌體進(jìn)行預(yù)處理，包括菌體培養(yǎng)階段的預(yù)處理和酶解前的預(yù)處理。 對于細(xì)菌可加入甘氨酸、青霉素和 D－環(huán)絲氨酸等，對于放線菌可以使用甘氨酸（ 1－ 4％）等，在酵母菌中加入 EDTA和巰基乙醇等。 菌體的培養(yǎng)時間 為了使菌體易于原生質(zhì)體化，一般選擇對數(shù)生長期的菌體。 一般對于細(xì)菌采用對數(shù)生長期后期為好，對于放線菌采用對數(shù)生長期與穩(wěn)定期之間的轉(zhuǎn)換期最為合適。 酶濃度 一般來講，酶濃度增加，原生質(zhì)體形成率增加，但是超過一定范圍，則原生質(zhì)體形成率增加的效果不明顯；酶濃度過低，則導(dǎo)致原生質(zhì)體再生率下降。 通常，采用當(dāng)原生質(zhì)體形成率和再生率之積達(dá)到最大時的酶濃度作為最佳酶濃度。 酶解溫度 溫度對酶解作用有雙重影響。一方面，隨著溫度的提高，酶解反應(yīng)速度加快；另一方面，隨著溫度的增加，酶蛋白逐漸變性而失活。因此，最適溫度是這兩方面的共同結(jié)果。 一般在選擇最佳溫度時，除了考慮酶的最適溫度外，還要以原生質(zhì)體再生率加以校正。 酶解時間 原生質(zhì)體的制備質(zhì)量與酶解時間有密切的關(guān)系。酶解時間過短，原生質(zhì)體形成不完全，結(jié)果會影響到融合；酶解時間過長，原生質(zhì)體脫壁太完全，原生質(zhì)體的質(zhì)膜也會受到損傷，從而會影響到再生，最終也不利于融合。 因此，選擇一個最適的酶解時間對于原生質(zhì)體融合是非常重要的。 原生質(zhì)體制備液（滲透壓穩(wěn)定劑） 高滲透壓 在原生質(zhì)體制備中不僅起到保護(hù)原生質(zhì)體免于膨脹作用，而且有助于酶與底物的結(jié)合。 滲透壓穩(wěn)定劑的選擇： 細(xì)菌－蔗糖、丁二酸鈉、 NaCl等 酵母菌－山梨醇、甘露醇等 霉菌－ KCL、 NaCl等 滲透壓穩(wěn)定劑的濃度一般采用 ～ ％ mol/L。 原生質(zhì)體形成率＝ 破壁前菌數(shù)－剩余菌數(shù) 破壁前菌數(shù) 100％ 原生質(zhì)體形成率的計算 （三）原生質(zhì)體的再生 一般在進(jìn)行原生質(zhì)體再生時，采用含有滲透壓穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。滲透壓穩(wěn)定劑的選擇同制備時是一樣的。 原生質(zhì)體的再生是一個復(fù)雜的過程，其影響因素有很多，包括菌體本身的再生特性、原生質(zhì)體制備的條件、再生培養(yǎng)基的成分、再生培養(yǎng)條件等等。 原生質(zhì)體再生率的計算 原生質(zhì)體再生率＝ 再生菌數(shù)－剩余菌數(shù) 破壁前菌數(shù)－剩余菌數(shù) 100% ＝ 再生菌數(shù)－總菌數(shù) （ 1－制備率） 總菌數(shù) 制備率 100% （四）原生質(zhì)體的融合 在進(jìn)行原生質(zhì)體融合是通常要加入聚合劑聚乙二醇（ PEG）。 PEG的分子量采用 4000～ 6000為好；融合時的終濃度一般為 30～ 40％；由于有 PEG加入使得融合很有效地進(jìn)行，同時 PEG在高濃度下是有毒的，因此聚合時間不宜過長。 在融合時，一般也加入 Ca2+，濃度以 ／ L為好。 （五）融合子的選擇 原生質(zhì)體融合后有兩種情況： 暫時的融合，形成異核體。 真正的融合，即產(chǎn)生雜合的二倍體或單倍重組體； 兩者均可以在選擇培養(yǎng)基上生長，一般前者較穩(wěn)定，而后一種則不穩(wěn)定。要獲得真正的融合子，必須在融合原生質(zhì)體后，進(jìn)行幾代自然分離、選擇，才能加以確定。 一般采用影印法。 （六）高產(chǎn)菌株的篩選 高產(chǎn)菌株的篩選需要在生產(chǎn)實踐中進(jìn)行選擇。 例如： 通過北京棒桿菌 1134衍生株（ Hser－ ， Bio－ ，Nal+， AEC r，）和枯草芽孢桿菌 BR151衍生株 （ Met－ ， Trp－ ， Rif r）之間的原生質(zhì)體融合獲得 了融合子 Q4413（ Met＋ , Trp＋ , Hser＋ ,Bio＋ , Rif r , AEC r， Nalr） 一、有性雜交（ Sexual Hybridization） 有性雜交一般指性細(xì)胞間接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產(chǎn)生新遺傳性后代的一種育種技術(shù)。 從理論上講，凡能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌都可應(yīng)用與高等動、植物雜交育種相似的有性雜交方法進(jìn)行育種。 第五節(jié) 真菌的有性雜交和準(zhǔn)性雜交 雜交是細(xì)胞水平上發(fā)生的一種遺傳重組方式。 項目 二倍體 單倍體 細(xì)胞 菌落 液體培養(yǎng) 在產(chǎn)子囊培養(yǎng)基上 大、橢圓形 大、形態(tài)均一 繁殖較快、細(xì)胞易分散 形成子囊 小、球形 小、形態(tài)變化較多 繁殖較慢、常聚集成團(tuán) 不形成子囊 S. Cerevisiae的二倍體和單倍體細(xì)胞比較 二、準(zhǔn)性雜交（ Parasexual Hybridization） 準(zhǔn)性生殖（ Parasexual reproduction或 Para－sexuality）是一種類似于有性生殖，但比它更為原始的一種生殖方式，它可以使同種生物的兩種不同菌株的體細(xì)胞發(fā)生融合，且不以減數(shù)分裂的方式導(dǎo)致低頻率的基因重組，并產(chǎn)生重組子。 準(zhǔn)性生殖常見于某些真菌中，如半知菌。其過程如下： 菌絲聯(lián)結(jié)（ anastomosis）； 形成異核體（ heterocaryon）； 核融合（ nuclear fusion） 。 體細(xì)胞交換（ somatic crossingover） 項目 準(zhǔn)性生殖 有性生殖 參與接合的親本細(xì)胞 獨立生活的異核體階段 接合后二倍體的形態(tài) 雙倍體變?yōu)閱伪扼w的途徑 接合發(fā)生的幾率 形態(tài)相同的體細(xì)胞 有 與單倍體基本相同 有絲分裂 偶爾發(fā)生、幾率低 形態(tài)或生理上有分化的性細(xì)胞 無 與單倍體明顯不同 減數(shù)分裂 正常出現(xiàn)、幾率高 準(zhǔn)性生殖與有性生殖的比較