【正文】 ab 4－ ab+ 原生質體的形成 融合 CW再生 穩(wěn)定 正變株的篩選 細胞原生質體融合程序示意圖 （一）標記菌株的篩選 在原生質體融合過程中，為了便于篩選，通常對于所用的 親株 都要進行一定的遺傳標記。 一般可以采用 營養(yǎng)缺陷標記 和 抗藥性標記 。 （二）原生質體的制備 在細菌和放線菌中主要采用溶菌酶 ； 在酵母菌和霉菌中一般可用蝸牛酶和纖維素酶。 影響原生質體制備的因素 菌體的預處理 為了使酶的作用效果更好一些，可對菌體進行預處理，包括菌體培養(yǎng)階段的預處理和酶解前的預處理。 對于細菌可加入甘氨酸、青霉素和 D－環(huán)絲氨酸等，對于放線菌可以使用甘氨酸（ 1－ 4％）等，在酵母菌中加入 EDTA和巰基乙醇等。 菌體的培養(yǎng)時間 為了使菌體易于原生質體化，一般選擇對數生長期的菌體。 一般對于細菌采用對數生長期后期為好，對于放線菌采用對數生長期與穩(wěn)定期之間的轉換期最為合適。 酶濃度 一般來講，酶濃度增加，原生質體形成率增加，但是超過一定范圍，則原生質體形成率增加的效果不明顯；酶濃度過低，則導致原生質體再生率下降。 通常，采用當原生質體形成率和再生率之積達到最大時的酶濃度作為最佳酶濃度。 酶解溫度 溫度對酶解作用有雙重影響。一方面，隨著溫度的提高，酶解反應速度加快；另一方面，隨著溫度的增加，酶蛋白逐漸變性而失活。因此，最適溫度是這兩方面的共同結果。 一般在選擇最佳溫度時，除了考慮酶的最適溫度外，還要以原生質體再生率加以校正。 酶解時間 原生質體的制備質量與酶解時間有密切的關系。酶解時間過短，原生質體形成不完全，結果會影響到融合；酶解時間過長，原生質體脫壁太完全，原生質體的質膜也會受到損傷，從而會影響到再生，最終也不利于融合。 因此，選擇一個最適的酶解時間對于原生質體融合是非常重要的。 原生質體制備液（滲透壓穩(wěn)定劑） 高滲透壓 在原生質體制備中不僅起到保護原生質體免于膨脹作用，而且有助于酶與底物的結合。 滲透壓穩(wěn)定劑的選擇： 細菌－蔗糖、丁二酸鈉、 NaCl等 酵母菌－山梨醇、甘露醇等 霉菌－ KCL、 NaCl等 滲透壓穩(wěn)定劑的濃度一般采用 ～ ％ mol/L。 原生質體形成率＝ 破壁前菌數－剩余菌數 破壁前菌數 100％ 原生質體形成率的計算 （三）原生質體的再生 一般在進行原生質體再生時，采用含有滲透壓穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。滲透壓穩(wěn)定劑的選擇同制備時是一樣的。 原生質體的再生是一個復雜的過程，其影響因素有很多，包括菌體本身的再生特性、原生質體制備的條件、再生培養(yǎng)基的成分、再生培養(yǎng)條件等等。 原生質體再生率的計算 原生質體再生率＝ 再生菌數－剩余菌數 破壁前菌數－剩余菌數 100% ＝ 再生菌數－總菌數 （ 1－制備率） 總菌數 制備率 100% （四）原生質體的融合 在進行原生質體融合是通常要加入聚合劑聚乙二醇（ PEG）。 PEG的分子量采用 4000～ 6000為好；融合時的終濃度一般為 30～ 40％；由于有 PEG加入使得融合很有效地進行，同時 PEG在高濃度下是有毒的，因此聚合時間不宜過長。 在融合時，一般也加入 Ca2+，濃度以 ／ L為好。 （五）融合子的選擇 原生質體融合后有兩種情況： 暫時的融合，形成異核體。 真正的融合，即產生雜合的二倍體或單倍重組體； 兩者均可以在選擇培養(yǎng)基上生長，一般前者較穩(wěn)定，而后一種則不穩(wěn)定。要獲得真正的融合子，必須在融合原生質體后，進行幾代自然分離、選擇，才能加以確定。 一般采用影印法。 （六）高產菌株的篩選 高產菌株的篩選需要在生產實踐中進行選擇。 例如： 通過北京棒桿菌 1134衍生株（ Hser－ ， Bio－ ，Nal+， AEC r，）和枯草芽孢桿菌 BR151衍生株 （ Met－ ， Trp－ ， Rif r）之間的原生質體融合獲得 了融合子 Q4413（ Met＋ , Trp＋ , Hser＋ ,Bio＋ , Rif r , AEC r， Nalr） 一、有性雜交（ Sexual Hybridization） 有性雜交一般指性細胞間接合和隨之發(fā)生的染色體重組，并產生新遺傳性后代的一種育種技術。 從理論上講，凡能產生有性孢子的酵母菌或霉菌都可應用與高等動、植物雜交育種相似的有性雜交方法進行育種。 第五節(jié) 真菌的有性雜交和準性雜交 雜交是細胞水平上發(fā)生的一種遺傳重組方式。 項目 二倍體 單倍體 細胞 菌落 液體培養(yǎng) 在產子囊培養(yǎng)基上 大、橢圓形 大、形態(tài)均一 繁殖較快、細胞易分散 形成子囊 小、球形 小、形態(tài)變化較多 繁殖較慢、常聚集成團 不形成子囊 S. Cerevisiae的二倍體和單倍體細胞比較 二、準性雜交（ Parasexual Hybridization） 準性生殖（ Parasexual reproduction或 Para－sexuality）是一種類似于有性生殖，但比它更為原始的一種生殖方式，它可以使同種生物的兩種不同菌株的體細胞發(fā)生融合，且不以減數分裂的方式導致低頻率的基因重組，并產生重組子。 準性生殖常見于某些真菌中，如半知菌。其過程如下： 菌絲聯結（ anastomosis）； 形成異核體（ heterocaryon）； 核融合（ nuclear fusion） 。 體細胞交換（ somatic crossingover） 項目 準性生殖 有性生殖 參與接合的親本細胞 獨立生活的異核體階段 接合后二倍體的形態(tài) 雙倍體變?yōu)閱伪扼w的途徑 接合發(fā)生的幾率 形態(tài)相同的體細胞 有 與單倍體基本相同 有絲分裂 偶爾發(fā)生、幾率低 形態(tài)或生理上有分化的性細胞 無 與單倍體明顯不同 減數分裂 正常出現、幾率高 準性生殖與有性生殖的比較