【正文】 出晾干。 ? 將固定晾干后的骨髓片，用 Giemsa應(yīng)用液染色 10~15min，輕微沖洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。 ? 顯微鏡觀察并計數(shù)微核率。 ? PCE呈灰藍色，成熟 RBC呈粉紅色， NC呈藍紫色。 ? PCE中含有的微核大小為細胞直徑的 1/201/5，呈圓形或橢圓形，邊緣光滑整齊，染色性與細胞核一致，呈紫紅色或藍紫色。一個細胞內(nèi)可以出現(xiàn)一個或多個微核。每張片計數(shù) 1000個 PCE中含微核的 PCE數(shù)。 3. 染色體畸變分析 ? 染色體畸變分析 (chromosome aberration analysis)： 觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目改變，又稱 細胞遺傳學(xué)試驗(cytogeic assay)。染色體畸變只能在細胞分裂的中期相進行觀察和分析?？捎^察到裂隙、斷裂、斷片、染色體環(huán)、雙或多著絲粒染色體和染色體粉碎。 ? 為收集足夠的中期相細胞，在收獲細胞前，使用秋水仙堿處理，以阻斷微管蛋白的聚合，抑制細胞分裂時紡錘體的形成，使分裂間期和前期的細胞停留在中期相。 ? 細胞通過低滲處理，使染色體均勻散開，然后固定、染色，油鏡下觀察計數(shù)。 試驗步驟 ? 染毒：健康成年 ICR小鼠，實驗前 24小時予環(huán)磷酰胺 40mg/kg體重腹腔注射。 ? 收獲細胞：處死動物前 2~4h，秋水仙堿 4mg/kg腹腔注射。小鼠頸椎脫臼處死，取雙側(cè)后肢股骨，紗布擦去多余肌肉和血污，剪去兩端骨垢，用注射器吸 NS約 5 ml插入骨髓腔內(nèi)，將骨髓沖入離心管，吸管吹打骨髓團塊混勻，以 1500 r/min離心 10min，棄上清液。 ? 低滲：打散沉淀物，加入預(yù)溫 37℃ 的 mol/L KCl約 6ml，混勻，于 37℃ 低滲 15~20min，再加固定液 l~2 ml混勻，立即以1000r/min離心 10min，棄上清液。 ? 固定：重懸細胞，加入固定液 4ml混勻，放置室溫 10~20min，然后 1000r/min離心 10min，去上清液。同樣方法再固定一次，棄上清液，留約 。 ? 制片染色：使細胞懸浮，用吸管吸取細胞懸液，距預(yù)冰凍的載波片 10~15Cm高處滴片，干燥，用 10％ Giemesa染色液染色 10~20min，輕微沖洗，自然晾干。 ? 閱片計數(shù)。 ? 染色體數(shù)目改變包括： ? 整倍體變異：原先 2n的染色體變?yōu)槎啾扼w如 3n或 4n等。 ? 非整倍體變異：染色體組中的個別染色體增加或減少。 ? 染色體結(jié)構(gòu)改變包括：裂隙 (G)、斷裂 (B)、碎片 (F)、環(huán)形 (r)、交換(E)以及復(fù)合性斷裂等。 ? 小鼠和大鼠的染色體核型都為近端著絲點型。小鼠的染色體數(shù)為 40條，大鼠的染色體數(shù)為 42條。 ? 讀片時每張標本片至少要分析 100個中期分裂細胞。 %100% ??分析染色體的細胞數(shù)有染色體畸變細胞數(shù)）細胞畸變率（%100% ?? 分析染色體的總數(shù) 染色體畸變總數(shù)）染色體畸變率（4. 姐妹染色單體交換試驗 ? 姐妹染色單體： 從 DNA合成期染色體復(fù)制至有絲分裂后期中心粒分裂這段時間 ， 由同一個中心粒連在一起的二條子染色體稱為姐妹染色單體 。 ? 姐妹染色單體交換 (sisterchromatid exchange， SCE)： 二條姐妹染色單體之間的物質(zhì)交換就稱為姐妹染色單體交換。即染色體同源座位上 DNA復(fù)制產(chǎn)物的相互交換。如單體內(nèi) DNA鏈受損，則可能通過這種交換方式進行重組修復(fù)。 因此 SCE的出現(xiàn)常表明 DNA曾經(jīng)受損。 ? 將 5BrdU加入合成 DNA的原料中，經(jīng)過兩個分裂周期后，兩條染色單體的其中一條雙股 DNA鏈內(nèi)胸腺嘧啶核苷均被BrdU取代，另一條只有一股被取代。染色和光處理后，兩條染色單體的著色深淺不同。如果兩條染色單體間發(fā)生等位交換，可根據(jù)每條染色單體內(nèi)出現(xiàn)深淺不同的染色片段，在光鏡下進行識別，清晰分辨出交換的染色單體，計數(shù) SCE數(shù)，判斷受試物對 DNA是否有損傷作用。 姐妹染色單體交換試驗原理 5. 程序外 DNA合成試驗 ? 正常細胞需經(jīng)過細胞周期達到增殖的目的 ， 細胞周期包括G1期 、 S期 、 G2期和 M期 ， 在 S期的 DNA合成是按固定程序進行的 ， 稱為 程序性 DNA合成 (scheduled DNA synthesis)。 ? 當 DNA損傷時 ， 會發(fā)生在 S期半保留 DNA程序合成之外的DNA合成 ， 稱之為 程序外 DNA合成 (unscheduled DNA synthesis, UDS)。 它是機體為保證遺傳穩(wěn)定性而對 DNA雙鏈上出現(xiàn)的變異或損傷進行修復(fù)合成的過程 。 程序外 DNA合成試驗原理 ? 程序外 DNA合成試驗是觀察分離或培養(yǎng)的細胞 ， 加入標記 DNA合成原料 ， 如 3H胸苷 ， 在 S期外是否有 DNA合成發(fā)生 ， 即是以 3H胸苷摻入細胞量的增加 ， 判斷受試物是否造成 DNA損傷 。 6. 單細胞凝膠電泳 (SCGE)試驗 ? 單細胞凝膠電泳 (single cell gel electrophoresis, SCGE)試驗：在單細胞水平定量檢測有核細胞 DNA損傷與修復(fù)的方法 。 ? 原理： 將單細胞懸液均勻混合在低熔點瓊脂糖中 ， 裂解液使細胞膜和核膜破裂 ， 胞漿中的蛋白質(zhì)等釋放到裂解液中 ， 只有 DNA依然留在原位 ， 強堿作用使 DNA雙鏈打開 ， 并將其置于電場中泳動 。 若 DNA發(fā)生斷裂 ， 則斷裂的小片段 DNA在電泳時泳動速度和大片段的 DNA產(chǎn)生差異 ， 出現(xiàn)如彗星一樣的拖尾現(xiàn)象 。 通過檢測拖尾率 ， DNA遷移距離等數(shù)據(jù) ， 可以觀察到 DNA損傷的程度 。 故又稱為 彗星試驗 （ et test)。 ? 優(yōu)點： 此方法檢測低水平 DNA損傷的敏感性高，對樣品的細胞數(shù)要求少，適應(yīng)性高，操作簡便，省時省力。 ? 缺點： 有待于標準化，尚未被國際組織接受。 7. 觀察方法的新進展 ? 轉(zhuǎn)基因小鼠致突變檢測系統(tǒng) ? 微核自動化檢測技術(shù) ? 熒光原位雜交技術(shù) 三、致突變試驗中的一些注意問題 ? 1. 陰性和陽性對照的設(shè)立 ? 2. 體外試驗的活化系統(tǒng) 3. 致突變試驗與致癌試驗的關(guān)系 ? 化學(xué)物按遺傳毒性和致癌性分類：遺傳毒性致癌物，非遺傳毒性致癌物，遺傳毒性非致癌物和非遺傳毒性非致癌物四類。 ? 致突變試驗僅可檢出遺傳毒性致癌物和非遺傳毒性非致癌物，有可能出現(xiàn)假陽性如遺傳毒性非致癌物和假陰性如非遺傳毒性致癌物。 ? 人類致癌物檢測方法有三大類：短期試驗，哺乳動物誘癌試驗和人類流行病學(xué)觀察。 ? 致突變試驗是短期致癌物檢測試驗中的一大類，它需與其他試驗結(jié)合，互為補充，以獲得可靠的結(jié)論。 4. 試驗結(jié)果在毒理學(xué)安全性評價中的作用 ? 在評定結(jié)果之前，應(yīng)首先檢查實驗的質(zhì)量控制情況。 ? 致突變試驗的質(zhì)量控制措施如下： ? 設(shè)立陰性對照和陽性對照； ? 盲法觀察，指觀察人員不了解觀察標本的染毒劑量或組別，以免除觀察人員對實驗數(shù)據(jù)產(chǎn)生主觀影響； ? 資料的統(tǒng)計學(xué)分析，它是檢驗各處理組與對照組之間的差異，研究劑量 反應(yīng)關(guān)系和定量強度； ? 試驗結(jié)果的重現(xiàn)性，即重復(fù)試驗所得到的相同結(jié)果。重復(fù)試驗指在不同時間完成的試驗，而并非試驗中的平行樣本。 ? 陽性結(jié)果判定條件 ? 具有劑量－反應(yīng)關(guān)系，即隨著劑量的增加，致突變作用也增加； ? 實驗組觀察值與陰性對照比較有顯著性差異，即表明受試物具有致突變性。 ? 陰性結(jié)果判定條件 ? 最高劑量應(yīng)包括受試物許可最大劑量或最大耐受量 ， 常選 LD50或 LD80為最大劑量； ? 各劑量組的組間差距不應(yīng)過大 ， 以防漏檢僅在非常狹窄范圍內(nèi)才有突變能力的某些化學(xué)物 。