醫(yī)學(xué)]20xx生化與分子生物學(xué)實(shí)用技術(shù)-資料下載頁
2025-01-04 05:54本頁面
【正文】 清移至另一 Ep管中； ? 用 2倍體積的乙醇，振蕩混勻，室溫放置 2分鐘； ? 12022g ， 4℃ 離心 5分鐘； ? 棄上清，加入 1ml 70％ (4℃ )乙醇振蕩漂洗沉淀， 12022g ，4℃ 離心 2分鐘； ? 棄上清，將 Ep管倒置放在濾紙上，室溫干燥沉淀； ? 用 50 ?l含有無 DNA酶的 RNA酶 (20?g/ml)的 TE重新溶解核酸，溫和振蕩幾秒鐘后可進(jìn)行內(nèi)切酶酶切實(shí)驗(yàn)或貯存于－20℃ 重組質(zhì)粒酶切鑒定 重組質(zhì)粒用 HindⅢ 和 BamHI 雙酶切，反應(yīng)體系如下： 質(zhì)粒 DNA 5 ?l 10 Y+/Tanqo（ with BSA） 1 ?l BamHI (10U/ ?l) ?l HindⅢ (10U/ ?l) ?l 加水至 10 ?l 酶切反應(yīng)結(jié)束后，電泳檢測酶切結(jié)果。 DNA重組技術(shù) 構(gòu)建重組體 轉(zhuǎn)化 篩選 重組體的檢測 表達(dá)體系的選擇 重組體的表達(dá) 選擇載體 獲得目的基因 原核表達(dá)與真核表達(dá)體系 大腸桿菌是常用的原核表達(dá)體系，具有遺傳背景清晰、成本低廉、表達(dá)水平高的優(yōu)點(diǎn)。真核蛋白常具有翻譯后修飾加工，比如糖基化、磷酸化、乙?；?、多聚化、二硫鍵形成等等。在原核表達(dá)體系中，不能完成這些翻譯后修飾加工，常常使一些表達(dá)的真核蛋白沒有活性，而真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后修飾加工的能力，常可獲得有活性的表達(dá)蛋白。 實(shí)驗(yàn)一、組織總 RNA的提取 ? 試劑： RNAout、氯仿、異丙醇、 75%乙醇、RNAse free水。 ? 步驟： ； 50~100mg組織加 1ml的 RNAout，勻漿30秒； 1ml的 RNAout加入 ，渦旋震蕩 30秒； 13000轉(zhuǎn) /分， 3分鐘； （約 ）轉(zhuǎn)移入新的 EP管； 注意：取上清要避免吸入中間層，防止 DNA或蛋白質(zhì)污染。 ，渦旋震蕩 30秒； 13000轉(zhuǎn) /分， 5分鐘； ； 1ml的 75%乙醇，震蕩 30秒； /分，離心 1分鐘； ； 9~11步一次； ，吸棄殘留乙醇； 注意：盡量不要?dú)埩粢掖迹瑫绊懙?RNA的使用。 1~2分鐘，加入 RNAse free水50ul溶解。 注意：應(yīng)使用無 RNAse的水溶解 RNA。 。 OD260=1(40ug/ml) OD260/OD280=~ 實(shí)驗(yàn)二、 RTPCR ：通用型 RTPCR試劑盒。 （ 20ul）： 溶液 A（隨機(jī)引物 RP） 1ul 溶液 B（ dNTP） 1ul 溶液 D（ 5*RT buffer） 4ul 溶液 E（酶混合液） 1ul 提取的總 RNA 1ul 溶液 G（ DEPC水） 12ul ： 混勻上述反應(yīng)體系， 42度 60分。 95度 5分鐘，4度 1~5分鐘。 （ 50ul）： RT反應(yīng)產(chǎn)物 4ul 溶液 F（ 10*PCR buffer） 5ul 溶液 B（ dNTP） 1ul 上游引物（ 10uM） 2ul 下游引物（ 10uM） 2ul 【 溶液 H（陽性對照引物 betaactin） 1ul】 溶液 C（ taq酶） 1ul 溶液 G（ DEPC水） 35ul ： 94度預(yù)變性 1分鐘 94度 30秒 55度 30秒 72度 30秒 30個循環(huán) 72度 5分鐘
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