醫(yī)學(xué)]20xx生化與分子生物學(xué)實(shí)用技術(shù)-全文預(yù)覽
【正文】 ? 加 LB培養(yǎng)基至 1ml ，輕輕搖蕩， 37℃ 振蕩培養(yǎng)，使得細(xì)菌恢復(fù)正常并讓氨芐青霉素抗性基因表達(dá)。 酶量。當(dāng)切割大量 DNA時(shí)，通常用延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間來(lái)減少酶的用量。一般總是在其它試劑加完后，再加入內(nèi)切酶。對(duì)于基因克隆，選擇粘性末端可提高連接效率。 目 錄 Cycle 3 重組 DNA技術(shù)的基本過(guò)程及技術(shù)路線 ? 分 獲取目的基因 ? 切 限制性內(nèi)切酶 ? 接 連接目的基因及載體 ? 轉(zhuǎn) 重組子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞 ? 篩 篩選出含有重組子的宿主細(xì)胞 mRNA 提取 cDNA PCR 瓊脂糖電泳 RTPCR 凝膠中回收 PCR產(chǎn)物 目的 DNA與載體雙酶切 DNA與載體的連接 轉(zhuǎn)化 質(zhì)粒的提取 酶切鑒定 測(cè) 序 表 達(dá) 以構(gòu)建 pBSKAkt1WT重組體為例 一、 PCR擴(kuò)增得到 Akt1/PKB的 cDNA 設(shè)計(jì)基因特異性引物 a、 b，以克隆在質(zhì)粒pCIS2Akt1上的 Akt/PKB cDNA為模板 5 ?端引入 HindⅢ 酶切位點(diǎn)， 3’引入 BamHI酶切位點(diǎn)，以 a、 b為引物，擴(kuò)增野生型 Akt1/ PKB。這一過(guò)程成為PCR。 ? 載體種類 1. 質(zhì)粒 (plasmid) 2. 噬菌體 (phage) 3. 柯斯質(zhì)粒 /粘粒 （ cosmid） 4. 人工染色體： 細(xì)菌人工染色體 （ bacterial artificial chromosome,BAC） 酵母人工染色體 （ yeast artificial chromosome,YAC） 哺乳動(dòng)物人工染色體（ mammalian artificial chromosome,MAC） 5. 動(dòng)物病毒 DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒） ?質(zhì)粒 (plasmid) 特點(diǎn) 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息 , 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀 。 ? DNA克隆 技術(shù)水平： 分子克隆 (molecular clone)即 DNA 克隆 細(xì)胞克隆 個(gè)體克?。▌?dòng)物或植物） DNA克隆 應(yīng)用酶學(xué)的方法 ， 在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì) （ 同源的或異源的 、 原核的或真核的 、 天然的或人工的 DNA） 與載體 DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的 DNA分子 —— 復(fù)制子 (replicon)， 繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞 ， 篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞 ， 再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA 分子 ， 也稱基因克隆或重組 DNA (rebinant DNA) 。 獲取同一拷貝的過(guò)程稱為克隆化 (cloning)， 即 無(wú)性繁殖 。 在重組 DNA技術(shù)中，常用基因載體有兩種類型： 克隆載體 表達(dá)載體 ?載體的特點(diǎn) ? 具有自主復(fù)制能力，保證重組 DNA分子可以在宿主細(xì)胞內(nèi)得到擴(kuò)增； ? 具有較多的拷貝數(shù)，易與宿主細(xì)胞的染色體 DNA分開，便于分離提純； ? 具有一個(gè)或多個(gè)篩選標(biāo)記（如對(duì)抗生素的抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型或顯色表型反應(yīng)等），便于重組體的篩選和鑒定； ? 有克隆位點(diǎn)（外源 DNA插入點(diǎn)），常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)，便于目的基因的克??； ? 分子量相對(duì)較小，易于操作，以容納較大的外源 DNA； ? 具有較高的遺傳穩(wěn)定性； ? 使用安全。 DNA文庫(kù) (genomic DNA library) 3. cDNA文庫(kù) (cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 重組 DNA分子 cDNA文庫(kù) 反轉(zhuǎn)錄酶
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