醫(yī)學(xué)]20xx生化與分子生物學(xué)實用技術(shù)-預(yù)覽頁
【正文】 載體 受體菌 復(fù)制 * 從 cDNA文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 Ⅰ 堿水解 T T T T 目 錄 聚 合 酶 鏈 反 應(yīng) Polymerase Chain Reaction 以擬擴增的 DNA分子為模板，以一對分別與模板 5′末端和 3 ′末端相互補的寡核苷酸片段為引物，在 DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的 DNA合成，重復(fù)這一過程，即可使目的 DNA片段得到擴增。 PCR的基本反應(yīng)步驟 變性 95?C 延伸 72?C 退火 50?C 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 一、基本工作原理 目 錄 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～ 30 次循環(huán)后，模板 DNA的含量可以擴大 100萬倍以上。 電泳檢測回收的 PCR產(chǎn)物 二、 PCR產(chǎn)物和表達載體的限制性內(nèi)切酶酶切 酶切體系的組成及注意事項 內(nèi)切酶 ：根據(jù)實驗的目的選擇限制性內(nèi)切酶。 限制酶操作時應(yīng)注意的原則： ? 限制性內(nèi)切酶從冰箱中取出后，應(yīng)置于冰中。 ? 酶應(yīng)分裝成小份。 粘性末端的連接一般在 16℃ 進行，以保證粘性末端退火及酶活性、反應(yīng)速率之間的平衡。 插 入 片 斷 所 需 量 （ n g ） =載 體 含 量 （ n g ） 插 入 片 斷 長 度 （ k b ）載 體 長 度 （ k b ）插 入 片 段 與 載 體 分 子 數(shù) 的 比 例四、重組體導(dǎo)入受體細胞 受體菌條件 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài) (petent) 導(dǎo)入方式 轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染 (transfection) 感染 (infection) 在重組 DNA技術(shù)中 轉(zhuǎn)化：將質(zhì)粒 DNA或以它為載體構(gòu)建的重 組子導(dǎo)入細菌的過程。挑取單菌落于 Amp + LB 培養(yǎng)基中， 37℃ 振蕩培養(yǎng)過夜。1% SDS(此溶液必須新鮮配制 ) ? 溶液 III: 5mol/L KAc 60ml。 DNA重組技術(shù) 構(gòu)建重組體 轉(zhuǎn)化 篩選 重組體的檢測 表達體系的選擇 重組體的表達 選擇載體 獲得目的基因 原核表達與真核表達體系 大腸桿菌是常用的原核表達體系，具有遺傳背景清晰、成本低廉、表達水平高的優(yōu)點。 ? 步驟： ； 50~100mg組織加 1ml的 RNAout，勻漿30秒； 1ml的 RNAout加入 ，渦旋震蕩 30秒； 13000轉(zhuǎn) /分， 3分鐘； （約 ）轉(zhuǎn)移入新的 EP管； 注意：取上清要避免吸入中間層，防止 DNA或蛋白質(zhì)污染。 。 （ 50ul）： RT反應(yīng)產(chǎn)物 4ul 溶液 F（ 10*PCR buffer） 5ul 溶液 B（ dNTP） 1ul 上游引物（ 10uM） 2ul 下游引物（ 10uM） 2ul 【 溶液 H（陽性對照引物 betaactin） 1ul】 溶液 C（ taq酶） 1ul 溶液 G（ DEPC水） 35ul ： 94度預(yù)變性 1分鐘 94度 30秒 55度 30秒 72度 30秒 30個循環(huán) 72度 5分鐘
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