醫(yī)學]20xx生化與分子生物學實用技術-文庫吧
2024-12-20 05:54 本頁面
【正文】 的特點 ? 具有自主復制能力，保證重組 DNA分子可以在宿主細胞內得到擴增； ? 具有較多的拷貝數，易與宿主細胞的染色體 DNA分開，便于分離提純； ? 具有一個或多個篩選標記（如對抗生素的抗性、營養(yǎng)缺陷型或顯色表型反應等），便于重組體的篩選和鑒定； ? 有克隆位點（外源 DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點，便于目的基因的克??； ? 分子量相對較小，易于操作，以容納較大的外源 DNA； ? 具有較高的遺傳穩(wěn)定性； ? 使用安全。 ? 載體種類 1. 質粒 (plasmid) 2. 噬菌體 (phage) 3. 柯斯質粒 /粘粒 （ cosmid） 4. 人工染色體： 細菌人工染色體 （ bacterial artificial chromosome,BAC） 酵母人工染色體 （ yeast artificial chromosome,YAC） 哺乳動物人工染色體（ mammalian artificial chromosome,MAC） 5. 動物病毒 DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒） ?質粒 (plasmid) 特點 能在宿主細胞內獨立自主復制；帶有某些遺傳信息 , 會賦予宿主細胞一些遺傳性狀 。 細菌中獨立于染色體外的雙鏈閉環(huán) DNA分子 。 目的基因的獲取 1. 化學合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其 產物的氨基酸序列 。 DNA文庫 (genomic DNA library) 3. cDNA文庫 (cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction, PCR) mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 重組 DNA分子 cDNA文庫 反轉錄酶 載體 受體菌 復制 * 從 cDNA文庫獲取目的基因 逆轉錄酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 Ⅰ 堿水解 T T T T 目 錄 聚 合 酶 鏈 反 應 Polymerase Chain Reaction 以擬擴增的 DNA分子為模板，以一對分別與模板 5′末端和 3 ′末端相互補的寡核苷酸片段為引物，在 DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的 DNA合成，重復這一過程，即可使目的 DNA片段得到擴增。這一過程成為PCR。 ? 模板 DNA ? 特異性引物 ? 耐熱 DNA聚合酶（ Taq 酶） ? dNTPs ? Mg2+ PCR體系基本組成成分 PCR的基本反應步驟 ：將反應系統加熱至 95℃ ，使模板 DNA 完全變性成為單鏈； ：將溫度下降至 50℃ 左右，使引物與模板 DNA退火結合； 3. 延伸：將溫度升至 72℃ ， DNA聚合酶以 dNTPs 為底物催化 DNA的合成反應。 上述三個步驟為一個循環(huán)，經 25～ 30次循環(huán)后，可將模板 DNA擴增達百萬倍。 PCR的基本反應步驟 變性 95?C 延伸 72?C 退火 50?C 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 一、基本工作原理 目 錄 Cycle 3 5?
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