醫(yī)學]20xx生化與分子生物學實用技術-在線瀏覽
2025-02-21 05:54本頁面
【正文】 源 DNA； ? 具有較高的遺傳穩(wěn)定性； ? 使用安全。 細菌中獨立于染色體外的雙鏈閉環(huán) DNA分子 。 DNA文庫 (genomic DNA library) 3. cDNA文庫 (cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應 (polymerase chain reaction, PCR) mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 重組 DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復制 * 從 cDNA文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 Ⅰ 堿水解 T T T T 目 錄 聚 合 酶 鏈 反 應 Polymerase Chain Reaction 以擬擴增的 DNA分子為模板，以一對分別與模板 5′末端和 3 ′末端相互補的寡核苷酸片段為引物，在 DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的 DNA合成，重復這一過程，即可使目的 DNA片段得到擴增。 ? 模板 DNA ? 特異性引物 ? 耐熱 DNA聚合酶（ Taq 酶） ? dNTPs ? Mg2+ PCR體系基本組成成分 PCR的基本反應步驟 ：將反應系統(tǒng)加熱至 95℃ ，使模板 DNA 完全變性成為單鏈； ：將溫度下降至 50℃ 左右，使引物與模板 DNA退火結合； 3. 延伸：將溫度升至 72℃ ， DNA聚合酶以 dNTPs 為底物催化 DNA的合成反應。 PCR的基本反應步驟 變性 95?C 延伸 72?C 退火 50?C 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 一、基本工作原理 目 錄 Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～ 30 次循環(huán)后，模板 DNA的含量可以擴大 100萬倍以上。 ? 引物 a(劃線部分為 HindⅢ 酶切位點 )： ? 5′GCGAAGCTTCCATGAACGACGTAGCCATTGT3′ ? 引物 b(劃線部分為 BamHI 酶切位點 )： ? 5′ATTGGATCCTCAGGCTGTGCCACTGGCTGAG3′ PCR產(chǎn)物末端限制酶切位點的切斷情況 10 PCR反應緩沖液 ?l dNTP mix(2mmol/L) ?l Ex Taq DNA聚合酶 (5U/?l ) ?l 引物 a (10pmol/?l ) ?l 引物 b (10pmol/?l ) ?l pCIS2Akt1 5ng 加水至 50 ?l 應用 TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶，反應體系為 50 ?l 94℃ 預變性 1min， 然后按照 94℃ 30sec， 63℃ 45sec，72℃ 1min， 進行 29個 循環(huán) ， 最后 72℃ 延伸 10min 。 電泳檢測回收的 PCR產(chǎn)物 二、 PCR產(chǎn)物和表達載體的限制性內(nèi)切酶酶切 酶切
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