[農(nóng)林牧漁]糧油檢測-蛋白質(zhì)及氨基酸的測定-資料下載頁
2025-10-09 22:44本頁面
【正文】 譜法是基于離子交換樹脂上可電離的離子與樣品中具有相同電荷的離子進行可逆交換 ， 依據(jù)樣品離子對離子交換樹脂具有不同的親和力而將它們分離的一種色譜方法 。 2021/11/10 國家糧食儲備局標準質(zhì)量中心 33 四、氨基酸測定 2．基本原理 對蛋白質(zhì)樣品進行各種前處理后進行酸或堿水解，生成各種氨基酸。借助氨基酸自動分析儀，采用離子交換色譜法對水解氨基酸樣品進行分離分析，或者采用化學(xué)方法對水解氨基酸樣品進行分析。 對于不同氨基酸的測定、采用不同的分離分析方法，對蛋白質(zhì)樣品應(yīng)選擇不同的前處理方法。 2021/11/10 國家糧食儲備局標準質(zhì)量中心 34 四、氨基酸測定 3．分析步驟 1) 制備樣品 氨基酸測定中樣品制備工作主要是對樣品進行粉碎、過篩、縮分。 2) 樣品前處理 (1) 蛋白質(zhì)水解前處理 蛋白質(zhì)樣品中氨基酸的測定比較復(fù)雜，針對不同氨基酸的測定，需對水解前的蛋白質(zhì)進行適當(dāng)?shù)奶幚怼? 2021/11/10 國家糧食儲備局標準質(zhì)量中心 35 四、氨基酸測定 水解前的蛋白質(zhì)處理方法 ① 對于飼料蛋白質(zhì)中有效賴氨酸的測定，首先將蛋白質(zhì)中游離的 ε 氨基 (有效賴氨酸部分 )進行衍生處理，即用 2,4二硝基氟苯 (FDNB)與蛋白質(zhì)進行反應(yīng)，生成 ε 二硝基苯蛋白。樣品衍生處理后反復(fù)用乙醚萃取，將樣品中 α DNP氨基酸、剩余的二硝基氟苯等雜質(zhì)去除干凈。 未經(jīng)處理的蛋白質(zhì)樣品，酸解后的賴氨酸全部為ε 氨基 賴氨酸 (總賴氨酸 )，經(jīng)處理后的蛋白質(zhì)樣品，酸解生成 ε 二硝基苯 賴氨酸 (有效賴氨酸部分 )和 ε 氨基 賴氨酸 (無效賴氨酸部分 )?？傎嚢彼岷蜔o效賴氨酸含量之差，即為有效賴氨酸含量。 2021/11/10 國家糧食儲備局標準質(zhì)量中心 36 四、氨基酸測定 ② 對于飼料中蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸的測定，首先對蛋白質(zhì)中含硫基團進行保護性處理，用過甲酸氧化蛋氨酸、半胱氨酸和胱氨酸的甲硫基和巰基，生成相映的甲基砜和磺酸基，經(jīng)氧化處理的蛋白質(zhì)樣品酸水解后，含硫氨基酸穩(wěn)定地生成蛋氨酸砜和磺基丙氨酸。 過甲酸處理樣品后，必須用氫溴酸或偏重亞硫酸鈉去除過甲酸，終止其氧化作用。 2021/11/10 國家糧食儲備局標準質(zhì)量中心 37 四、氨基酸測定 (2) 蛋白質(zhì)水解 不同氨基酸的測定，需采用不同的蛋白質(zhì)水解方法。 ① 酸水解法：用鹽酸水解蛋白質(zhì)時，除色氨酸完全被破壞，含硫氨基酸部分破壞外，大多數(shù)氨基酸能穩(wěn)定地存在于酸水解液中。 酸水解蛋白質(zhì)時，氨基酸與強酸長時間接觸，各種氨基酸都會有一定程度的破壞。如果蛋白質(zhì)樣品在水解前加適量的苯酚，水解管抽真空、充氮氣，則可以防止氨基酸脫氨、氧化。因此，酸水解法適用于各種樣品的氨基酸的測定。 ② 堿水解法：氫氧化鉀等強堿水解蛋白質(zhì)時，除色氨酸以外，其它氨基酸被脫氨分解。因此，堿水解法只適用于色氨酸的測定。 2021/11/10 國家糧食儲備局標準質(zhì)量中心 38 四、氨基酸測定 (3) 蛋白質(zhì)水解液處理 不同的氨基酸測定方法，要求對樣品水解液進行適當(dāng)?shù)奶幚怼? ① 一般蛋白質(zhì)樣品中氨基酸的測定，主要采用離子交換色譜法分離分析，影響離子交換色譜法分離效果的濃酸、濃堿及高濃度鹽必須去除干凈。酸水解液中的鹽酸可以用堿中和，當(dāng)水解液中高濃度鹽對分離效果有影響時，對水解液必須用真空低溫法脫除鹽酸。 ② 蛋白質(zhì)的堿水解液中，氨基酸主要為色氨酸。因此，采用化學(xué)方法直接進行測定，水解液不需再處理。 2021/11/10 國家糧食儲備局標準質(zhì)量中心 39 四、氨基酸測定 3) 氨基酸測定 不同的樣品前處理方法、不同的分析要求，可選擇不同的氨基酸分析方法。對于色氨酸測定的堿水解蛋白質(zhì)樣品，可直接用于化學(xué)方法的測定；酸水解蛋白質(zhì)樣品中氨基酸的測定，主要借助氨基酸自動分析儀，采用離子交換色譜法先分離再定量。在氨基酸分析時要注意： ① 離子交換色譜分離氨基酸時，洗脫液的 pH值和離子強度是影響分離效果的關(guān)鍵因素，洗脫液必須是使用規(guī)定試劑，按規(guī)定方法配制的緩沖溶液。 2021/11/10 國家糧食儲備局標準質(zhì)量中心 40 四 、 氨基酸測定 ② 當(dāng)樣品水解液的含酸 (或堿 )量超過洗脫液的緩沖能力時，必須對樣液進行適當(dāng)?shù)奶幚怼? ③ 多種氨基酸分析時，色譜條件 (柱溫、洗脫液流量等 )需調(diào)節(jié)到各種氨基酸達到最佳分離效果。 ④ 個別氨基酸分析時，色譜條件調(diào)節(jié)到待測氨基酸達到最佳分離效果即可。 ⑤ 不同廠商提供的色譜柱、使用時間長短不同、大量分析對象不同的色譜柱，達到最佳分離效果時的色譜條件可能不一致。因此，國標中對最佳分離條件沒有規(guī)定，需要操作者在分析過程中調(diào)節(jié)。 2021/11/10 國家糧食儲備局標準質(zhì)量中心 41 第四節(jié) 蛋白質(zhì)及氨基酸的測定 蛋白質(zhì)及氨基酸的測定 結(jié)束
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