【導讀】奶制品氮含量測定技術的研究。燕山大學里仁學院。本科畢業(yè)設計（論文）。答辯日期：20xx年6月16日。燕山大學畢業(yè)設計（論文）任務書。題目來源科研課題（）生產(chǎn)實際（）自選題目（√）。利用凱氏定氮法，雙縮脲法，考馬斯亮藍法以及反相高效液相色譜法對牛奶以。找出最適合的蛋白質(zhì)測定的方法。掌握各種檢測方法的基本原理，明確每種檢測方法的基本內(nèi)容，熟練掌握分光。蛋白質(zhì)的檢測方法與乳制品中蛋白含量測定。周次第1～4周第5～10周第11～13周第14～16周第17～20周。的是有機溶劑沉淀法，使用乙腈提取牛奶中的蛋白質(zhì)。和紫外檢測器，用標準添加法對純牛奶樣品中的尿素和三聚氰胺的含量進行。的總氮含量，該方法消耗時間長，操作繁瑣。用反相高效液相色譜法測定時待測樣品在出峰處不會受到牛奶中其。它組分的干擾，因此可用于奶制品中尿素和三聚氰胺含量的準確檢測與分

　　

【正文】 積； V2 為空白樣消耗標準鹽酸體積。 根據(jù)公式： )(100]0 .0 1 4c)[( 21 ???????? mFVVX 其中： c= mol/ L F= m=5 g 代入上式可得到三組數(shù)據(jù)，如表 32 所示 表 32 凱氏定氮法的計算結(jié)果 組號 1 2 3 實測值 / g/100mL 平均值 / g/100mL 燕山大學本科生畢業(yè)設計（論文） 22 即用凱氏定氮法測得的純牛奶中的蛋白質(zhì)的含量為 g/100mL。 實驗結(jié)果及分析 該方法測得的蛋白質(zhì)含量為 X= g/100mL，而所用純牛奶樣品包裝上蛋白質(zhì)含量為 g/100mL，所以凱氏定氮法測得的氮含量是樣品中的蛋白氮與非蛋白氮的總和。因此，凱 氏定氮法適合用于測定樣品的總 的氮含量。 雙縮脲法的實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計算 中 2 中提到需要根據(jù)凱氏定氮法測得的牛奶中的氮含量配置尿素溶液和三聚氰胺溶液，使每毫升尿素溶液和三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量的方法對樣品進行摻雜。由于蛋白質(zhì)中氮元素的平均質(zhì)量分數(shù)為 16%，又通過計算可知，尿素（ CO(NH2)2）中的氮的質(zhì)量分數(shù)為 %，三聚氰胺 (C3N3(NH2)3)中氮的質(zhì)量分數(shù)為 %。根據(jù) 中得到 的牛奶中的蛋白質(zhì)的濃度為 g/100mL，可以計算出 中 2 中牛奶樣品摻雜所需要的尿素溶液的濃度為 g/100mL，所需三聚氰胺溶液的濃度為 g/100mL。 標準蛋白曲線的繪制 依照 中表 23 的方法用 722 型光柵分光光度計測各濃度標準酪蛋白溶液在 550nm處的吸光度值 A550nm，測得的數(shù)值如表 33 所示。 表 33 雙縮脲法測得的標準酪蛋白溶液在 550nm 處的吸光度值 A550nm 蛋白質(zhì)含量 / mg/mL 0 吸光度值 A550nm 0 0 0 第 3章 實驗結(jié)果與分析 23 0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .00 .10 .00 .10 .20 .30 .40 .50 .60 .70 .8吸光度A550nm蛋 白 質(zhì)含量（ mg/mL）Y = 0 5 1 0 . 0 1 2 1 8R2= 6 7 圖 31 雙縮脲法測得的酪蛋白標準曲線 其對應蛋白質(zhì)含量的吸光度的平均值分別為： 0、 、 、 、 。根據(jù)上述 數(shù)據(jù)作 蛋白質(zhì)含量 吸光度圖，得到 雙縮脲法測得的酪蛋白標準曲線， 如圖 31 所示。 圖 31 所示，雙縮脲法以酪蛋白為標準蛋白，由所繪制的標準曲線可知，其線性方程為 Y=，相關系數(shù)為 R2=，這表明酪蛋白與雙縮脲試劑的線性關系好，因此可知雙縮脲法所需的標準蛋白可以用酪蛋白。 雙縮脲法對摻雜尿素溶液的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 實驗數(shù)據(jù)及處理 依照 中 2）中的方法用 722 型光柵分光光度計進行測各摻入不同比例的尿素溶液的未知樣品溶液在 550nm處的吸光度值 A550nm，測得的數(shù)值如表 34 所示。 以根據(jù)表 34 中測得的 樣品的吸光度值在圖 31 所示的 標準曲線上查出對應的蛋白質(zhì)含量 (mg)，代入下式： 燕山大學本科生畢業(yè)設計（論文） 24 蛋白質(zhì)含量（ mg/mL） =標準曲線上查得的蛋白質(zhì)含量 （ mg/mL)50(mL) 247。 樣品體積（ mL） 計算可得雙縮脲法測定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質(zhì)的含量，如表 35 所示。 表 34 雙縮脲法測得的 摻雜 尿素溶液的未知樣品在 550nm 處的吸光度值 A550nm 試管編號 1 2 3 4 5 吸光度值 A550nm 表 35 雙縮脲法測定牛奶中摻入尿素溶液的蛋白質(zhì)含量 樣品號 實測值 / g/L 平均值 / g/L 理論值 / g/L 誤差率/ % RSD/% 1 2 3 4 5 結(jié)果分析 從表 35可以看出牛奶中摻入不同比例尿素溶液用雙縮脲法檢測摻假的牛奶中的蛋白質(zhì)含量的誤差率分別為 %、 %、 %、 %,其對應的標準偏差分別為 %、 %、 %、 %。由此看來，使用雙縮脲法測定摻入尿素的牛奶樣品的方法基本準確，但是該法測得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性第 3章 實驗結(jié)果與分析 25 和重現(xiàn)性一般，因此需要通過多次重復實驗得到多組數(shù) 據(jù)求平均值才可以得到比較準確的結(jié)果。 雙縮脲法對摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 實驗數(shù)據(jù)及處理 同理可得 用 722 型光柵分光光度計進行測各摻入不同比例的三聚氰胺溶液的未知樣品溶液在 550nm處的吸光度值 A550nm，測得的數(shù)值如表 36 所示。 表 36 雙縮脲法測得的添加三聚氰胺溶液的樣品在 550nm 處的吸光度值 A550nm 試管編號 1 6 7 8 9 吸光度值A550nm 表 37 雙縮脲法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)含量 樣品號 實測值 / g/L 平均值 / g/L 理論值 / g/L 誤差率/ % RSD/% 1 6 7 8 9 以根據(jù)表 36 中測得的 樣品的吸光度值在圖 31 所示的 標準曲線上查出燕山大學本科生畢業(yè)設計（論文） 26 對應的蛋白質(zhì)含量 (mg)，代入下式： 蛋白質(zhì)含量（ mg/mL） =標準曲線上查得的蛋白質(zhì)含量 （ mg/mL) 50(mL)247。 樣品體積（ mL） 計算可得雙縮脲法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)的含量，如表 37 所示。 結(jié)果分析 從表 37可以看出牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液 用雙縮脲法檢測摻假的牛奶中的蛋白質(zhì)含量的誤差率分別為 %、 %、 %、 %， 其對應的標準偏差分別為 %、 %、 %、 %。由此看來，使用雙縮脲法測定摻入三聚氰胺的牛奶樣品的方法比較準確，該法測得的數(shù)據(jù)的數(shù)值上的差異也不是很大，因此如通過多次重復實驗得到多組數(shù)據(jù)求平均值可以得到更加準確的結(jié)果。 考馬斯亮藍法的實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計算 中 2 中提到需要根據(jù)凱氏定氮法測得的牛奶中的氮含量配置尿素溶液和三聚氰胺溶液，使每毫升尿素溶液和三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測得的牛奶的氮含量的方法對樣品進行摻雜。由于蛋白質(zhì)中氮元素的平均質(zhì)量分數(shù)為 16%，又通過計算可知，尿素（ CO(NH2)2）中的氮的質(zhì)量分數(shù)為 %，三聚氰胺 (C3N3(NH2)3)中氮的質(zhì)量分數(shù)為 %。根據(jù) 中得到的牛奶中的蛋白質(zhì)的濃度為 g/100mL，可以計算出 中 2 中牛奶樣品摻雜所需要的尿素溶液的濃度為 g/100mL，所需三聚氰胺溶液的濃度為 g/100mL。 標準蛋白曲線的繪制 依照 中表 26 的方法用 722 型光柵分光光度計測各濃度標準酪蛋白溶液在 595nm處的吸光度值 A595nm，測得的數(shù)值如表 38 所示。 第 3章 實驗結(jié)果與分析 27 表 38 考馬斯亮藍法測得的標準酪蛋白溶液在 595nm 處的吸光度值 A595nm 蛋白質(zhì)含量/ 100μg/mL 0 吸光度值A595nm 0 0 0 其對應蛋白質(zhì)含量的吸光度的平均值分別為： 0、 、 、 、 。 根據(jù)上述數(shù)據(jù)作蛋白質(zhì)含量 吸光度圖，得到考馬斯亮藍法測得的酪蛋白標準曲線，如圖 38 所示。 圖 32 考馬斯亮藍法測得的酪蛋白標準曲線 圖 32 所示，考馬斯亮藍法以酪蛋白為標準蛋白，由所繪制的標準曲線可知，其線性方程為 Y=－ ，相關系數(shù)為 R2=，這表明酪蛋白與考馬斯亮藍 G250 試劑的線性關系好，因此可知考馬斯亮藍法所0 .0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1 .00 .0 50 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .3 50 .4 0吸光度A595nm蛋 白 質(zhì)含量(100 μ g/mL)Y = 1 5 7 0 7 1R2= 2 3燕山大學本科生畢業(yè)設計（論文） 28 需的標準蛋 白可以用酪蛋白。 考馬斯亮藍法對摻雜尿素的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 實驗數(shù)據(jù)及處理 依照 中 2）中的方法用 722 型光柵分光光度計進行測各摻入不同比例的尿素溶液的未知樣品溶液在 595nm處的吸光度值 A595nm，測得的數(shù)值如表 39 所示。 以根據(jù)表 39 中測得的 樣品的吸光度值在圖 32 所示的 標準曲線上查出對應的蛋白質(zhì)含量 (mg)，代入下式： 蛋白質(zhì)含量（ mg/mL） =標準曲線上查得的蛋白質(zhì)含量 （ μg/mL) 500(mL) 247。[ 樣品體積（ mL） 1000] 計算可得考馬斯亮藍 法測定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質(zhì)的含量，如表 310 所示。 表 39 考馬斯亮藍法測得的添加尿素溶液的樣品在 595nm 處的吸光度值 A595nm 試管編號 1 2 3 4 5 吸光度值 A595nm 結(jié)果分析 從表 35可以看出牛奶中摻入不同比例尿素溶液用考馬斯亮藍法檢測摻假的牛奶 中的蛋白質(zhì)含量的誤差率分別為 %、 %、 %、 %,其對應的標準偏差分別為 %、 %、 %、 %。 由此看來，使用考馬斯亮藍法測定摻入尿素的牛奶樣品的方法與理論差值的誤差比較大，但是該法測得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，因此該方法可以不通過進行多次重復實驗就可以得到結(jié)果。 第 3章 實驗結(jié)果與分析 29 表 310 考馬斯亮藍法測定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質(zhì)含量 樣品號 實測值 / g/L 平均值 / g/L 理論值 / g/L 誤差率/ % RSD/% 1 2 3 4 5 考馬斯亮藍法對摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 實驗數(shù)據(jù)及處理 同理可得 用 722 型光柵分光光度計進行測各摻入不同比例的三聚氰胺溶液的未知樣品溶液在 595nm 處的吸光度值 A595nm，測得的數(shù)值如表 311所示。 以根據(jù)表 311 中測得的 樣品的吸光度值在圖 32 所示的 標準曲線上查出對應的蛋白質(zhì)含量 (mg)，代入下式： 蛋白質(zhì)含量 （ mg/mL） =標準曲線上查得的蛋白質(zhì)含量 （ μg/mL) 500(mL) 247。 [樣品體積 （ mL） 1000] 表 311 考馬斯亮藍法測得的添加三聚氰胺的未知樣品在 595nm 處的吸光度值 A595nm 試管編號 1 6 7 8 9 吸光度值 A595nm 計算可得考馬斯亮藍法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)的含量，如表 312 所示。 燕山大學本科生畢業(yè)設計（論文） 30 表 312 考馬斯亮藍法測定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)含量 樣品號 實測值 / g/L 平均值/ g/L 理論值/ g/L 誤差率/ % RSD/% 1 6 7 8 9 結(jié)果分析 從表 312 可以看出牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液用考馬斯亮藍法檢測摻假的牛奶中的蛋白質(zhì)含量的誤差率分別為 %、 %、 %、%， 其對應的標準偏差分別為 %、 %、 %、 %。 由此看來，使用考馬斯亮藍法測定摻入三聚氰胺的牛奶樣品的方法與理論差值的誤差比較大，但是該法測得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，因此該方法可以不通過進行多次重復實驗就可以得到結(jié)果。 由 和 中的數(shù)據(jù)分析可知，考馬斯亮藍法的準確性不如雙縮脲法得出的結(jié)果準確，但是在理論上考馬斯亮藍法的準確度應該比雙縮脲法的準確度高，通過查閱資料我們了解到，牛奶中的酪蛋白在酸性條件下會析出[34]，因而導致吸 光度降低，所以用考馬斯亮藍法實際測的結(jié)果會比雙縮脲法的小。 反向高效液相色譜法的實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 尿素標準曲線和三聚氰胺標準曲線的繪制 尿素標準曲線 使用高效液相色譜儀，按照 中 3 中 1）的色譜條件對 中 1 中1）所處理好的不同濃度的尿素標準溶液進行進樣檢測，測得的峰面積如表313 所示。 第 3章 實驗結(jié)果與分析 31