【文章內(nèi)容簡介】 些氨基酸的濃度，同時也取 決于叔肽的量，因為兩者都會使福林 酚試劑的量減少 [34]， 在一定的條件下 ,藍(lán)色的深度與蛋白的量是成正比的。 （ 2）優(yōu)缺點 Lowry 法的優(yōu)點在于它的靈敏度高 ,與雙縮脲法相比，它的靈敏度要高得多。其缺點有：消耗時間較長 ,而且要精確的控制操作的時間 ,標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式 ,且專一性較差 ,干擾物質(zhì)較多。 對雙縮脈反應(yīng)發(fā)生干擾的離子 ,同樣容易干擾福林 酚反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。 需要注意的是，在進行測定時 ,加入福林 酚試劑時要特別小心 ,因為該燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 6 試劑僅在酸性條件下穩(wěn)定 ,但上述的還原反應(yīng)只能在 pH=10的 情況下才可以進行 ,故當(dāng)福林 酚試劑加入堿性的銅 蛋白質(zhì)溶液中時 ,必須立即混勻 ,以便在磷鋁酸 磷鎢酸試劑在遭到破壞之前 ,還原反應(yīng)就能發(fā)生 [15]。 考馬斯亮藍(lán)法（ Bradford 法） 由于 Biuret 法和 Lowry 法存在著很多的弊端，因此人們開始去尋找更加完善的蛋白質(zhì)測定方法。 Bradford 在 1976 年根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計而建立了考馬斯亮藍(lán)法，這種測定蛋白質(zhì)的方法具有超過其他幾種方法的突出的優(yōu)點 ,因而得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法 [16]。 （ 1）實驗原 理 由于考馬斯亮藍(lán) G250 染料存在著兩種不同的顏色形式 —— 棕紅色和藍(lán)色，在酸性溶液中染料與蛋白質(zhì)中的芳香族氨基酸和某些堿性氨基酸發(fā)生反應(yīng) ,使染料的最大吸收峰的位置 (λmax)由 465 nm 變?yōu)?595 nm， 溶液的顏色也由棕紅色變?yōu)樗{(lán)色。在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi) (101000 μg/mL)， 蛋白質(zhì)和染料結(jié)合的規(guī)律符合比爾定律 (Beer’s Law)[17]。通過測定在 595 nm 下的吸光度值 A595nm， 可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。 蛋白質(zhì)和染料結(jié)合的過程很快 ,只需 2 min左右 即可完全反應(yīng) ,呈現(xiàn)出最大光的吸 收 ,并且穩(wěn)定時間長達(dá) 1 h。超過穩(wěn)定時間 之后 ,蛋白質(zhì) 染料復(fù)合物就會發(fā)生聚合并沉淀出來。蛋白質(zhì) 染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù) ,因此在測定蛋白質(zhì)時的靈敏度很高 [18,19]。 （ 2） 優(yōu)缺點 考馬斯亮藍(lán)法的優(yōu)點在于它的靈敏度高。與福林 酚試劑法相比，考馬斯亮藍(lán)法的靈敏度要高四倍左右 ,其最低的蛋白質(zhì)檢測量可低達(dá) 10μg。這是因為蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán) G250 染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色的變化很大 ,再加上蛋白質(zhì) 染料復(fù)合物又有很高的消光系數(shù) ,因而吸光度值隨蛋白質(zhì)濃度的變化要比福林 酚試劑法大的多 [20]。 Bradford 法測 定蛋白質(zhì)含量的另一個優(yōu)點在于它測定的快速和簡便性。完成一個樣品的測定 , 只需加一種試劑，并且只需要 5 分鐘左右即可。由于考馬斯亮藍(lán) G250 染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程大第 1章 緒論 7 約只要 2 分鐘就可以完成 ,其顏色可以在 1 小時內(nèi)保持穩(wěn)定 ,且在 5 分鐘至20 分鐘之間時的顏色的穩(wěn)定性最好，因而 Bradford 法完全不用像福林 酚法那樣費時并且還必須嚴(yán)格地控制時間 [21]。除上述優(yōu)點之外， Bradford 法干擾物質(zhì)少，如干擾福林 酚試劑法的 K+、 Na+、 Mg2+ 離子、 Tris 緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、 EDAT 等物質(zhì)均不會對 Bradford 法造成干擾 [22]。 Bradford 法在測定蛋白質(zhì)含量時也有一些不足之處。由于不同種類的蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量分布不同 ,因此考馬斯亮藍(lán)法在測不同的蛋白質(zhì)時會有較大的偏差 ,在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時通常選用 γ球蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白以減少這方面的偏差 [23]。另外， Bradford 法在測定蛋白質(zhì)含量時也仍然存在一些物質(zhì)的干擾 ,主要的干擾物質(zhì)有 :去污劑、 Trtion X100、十二烷基磺酸鈉 (SDS)和氫氧化鈉 [24]。第三，標(biāo)準(zhǔn)曲線在蛋白質(zhì)濃度較大時有輕微的非線性 ,因此不能使用比爾定律直接進行 計算 ,而只能通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度 [25]。除此之外，在測定中 , 也會有少部分的蛋白 染料復(fù)合物吸附于比色皿的壁上 ,實驗證明這種蛋白 染料復(fù)合物的吸附的影響是可以忽略的 ,實驗完畢后用乙醇可以將藍(lán)色的比色皿清洗干凈。 高效液相色譜法（ HPLC） 高效液相色譜法（ High Performance Liquid Chromatography / HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用 高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)。 高效液相色譜法是在經(jīng)典的液相色譜法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。高效液相色譜法是在高壓條件下，溶質(zhì)在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次交換的過程，它借溶質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同而引起排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離 [26]。 高效液相色譜法有“四高一廣 ”的特點： 燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 8 ① 高壓：流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。 ② 高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在 15～ 30分鐘，有些樣品甚至在 5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于 1小時。 ③ 高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。 ④高靈敏度：紫外檢測器可達(dá) ng，進樣量在微升數(shù)量級。 ⑤ 應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、 熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。 此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有“柱外效應(yīng)”。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴散和滯留都會顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。 高效液相色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法。其中，正向色譜法是采用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵 合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時間。常用于分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。而反向色譜法則一般用非極性固定相（如 C1 C8)；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調(diào)節(jié)保留時間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。 RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計，它占整個 HPLC應(yīng)用的 80%左右。 課題研究的意義 奶制品已經(jīng)成為每個家 庭的生活必需品，由于中國家庭較多，對奶制品第 1章 緒論 9 的需求量大，因此有不少廠商為牟取暴利，向奶制品中摻假。在原奶中摻雜摻假 [27,28]，這種丑惡行為既影響了牛奶的品質(zhì)，又損害了消費者的健康，在社會產(chǎn)生了極大的反響。然而在牛奶中摻入廉價的水解蛋白、其他動物乳或者含氮有機化合物等新的摻假方式，傳統(tǒng)的檢測方法 [2934]則難以檢出，現(xiàn)在的乳品檢測技術(shù)往往是等參假物出來后才能確定相對的檢測技術(shù)，因而不能未卜先知。為此，急需建立適應(yīng)新?lián)郊偾闆r的快速、準(zhǔn)確的檢測方法。本實驗對牛奶蛋白質(zhì)進行檢驗，對牛奶中的蛋白質(zhì)進行定量檢測， 為牛奶的摻假檢驗提供可靠數(shù)據(jù)，以確保奶制品的質(zhì)量和安全。 本研究的目的是從幾種傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)測定方法中來尋找適合乳品蛋白質(zhì)測定的方法。主要選用考馬斯亮藍(lán)法 (Bradford法 ) [29,35]，雙縮脲法 [31]，與凱氏定氮法的結(jié)果進行比較，從中找出最適合乳源蛋白質(zhì)測定的方法。由于福林 酚試劑法對實驗時間要求嚴(yán)格，而實驗室的設(shè)備條件不能達(dá)到要求，所以本課題中將不再用此方法進行蛋白質(zhì)含量的測定。本課題還研究反相高效液相色譜法 [33]對牛乳蛋白和常見的三種可能摻假蛋白質(zhì)進行定性分析，以期建立有效可行的分析檢測乳蛋白 成分和牛乳中蛋白質(zhì)摻假的方法。 課題研究的主要內(nèi)容 本課題的主要研究內(nèi)容包括以下幾個問題： （ 1） 通過凱氏定氮法準(zhǔn)確測定牛奶中的蛋白質(zhì)的含量。 （ 2） 使用雙縮脲 (Lowry)法、 Bradford方法檢測牛奶中的蛋白質(zhì)的含量，并與國標(biāo)法結(jié)果進行比較。 （ 3） 使用雙縮脲 (Lowry)法、 Bradford方法對于牛奶中摻入不同比例的尿素溶液、三聚氰胺溶液樣品，樣品經(jīng)前處理后，看能否準(zhǔn)確測定牛乳蛋白含量。 （ 4） 應(yīng)用反相高效液相色譜法（ RPHPLC）對牛奶中的三聚氰胺和尿素的含量進行測定。 燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 10 第 2章 實驗材料及方法 用凱氏定氮法測定牛奶中的蛋白質(zhì)含量 實驗儀器及藥品 實驗儀器：凱氏定氮裝置、凱氏燒瓶、冷凝管、接收瓶、燒杯、移液管、100 mL 容量瓶 、 量筒 、 酸式滴定管 、 分析天平、電熱套、研缽 、 藥匙、玻璃棒、膠頭滴管、吸管、燒杯和試管若干、鐵架臺等。 實驗藥品：純牛奶、 96%濃硫酸、 40%(m/m)氫氧化鈉溶液、 20 g/L 的硼酸溶液、 、 無水 乙醇、中性甲基紅、亞甲藍(lán)溶液、硫酸鉀、五水硫酸銅、 30%過氧化氫、蒸餾水等。 實驗操作及步驟 試 劑的配制 1) 40%的氫氧化鈉溶液： 40 g 氫氧化鈉加蒸餾水定容至 100 mL。 2) mol/L 鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：可先配制成 mol/L 的母液，用時吸取 10 mL 定容至 100 mL。 3) 2%的硼酸溶液： 2g 硼酸加蒸餾水定容至 100 mL。 4) 混合催化劑 ： 五水硫酸銅和硫酸鉀分別研碎 ,按 1:15 的比例混合均勻。 5) 混合指示劑 ： %的甲基紅乙醇溶液（ g 甲基紅試劑溶于 20 mL無水乙醇 乙醇，稀釋至 100 mL） 20 mL 與 %亞甲基藍(lán)乙醇溶液（ 2 g 亞甲基藍(lán)定溶于 100 ml 無水乙醇中） 10 mL 混合搖勻。 分析步驟 取 6 個凱氏燒瓶，編號 6，其中 3 號為待測樣品， 6 號為空白對照，分別按下述方法進行操作。 1) 試樣消化。 精密稱取牛奶樣品（空白樣為加蒸餾水） 5 ml,小心放入干燥的凱氏燒瓶中 , 避免試樣附著在管壁；加入混合催化劑 10 g, 與試樣混合均勻； 再加入 25 mL 硫酸和 5 mL 的雙氧水；然后將燒瓶以 45176。角斜放在支架上，用第 2章 實驗材料及方法 11 電爐緩慢加熱，當(dāng)瓶內(nèi)泡沫消失后強熱至沸。待瓶壁不附有炭化物時，且瓶內(nèi)液體為澄清淺綠色后，繼續(xù)加 熱 30 min 使其完全分解。消煮好后關(guān)閉熱源讓其自然降溫。 2) 堿化蒸餾。 將消化好并冷卻至室溫的樣品溶液全部轉(zhuǎn)移到 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度搖勻。向 100 mL 接受瓶中加入 20 mL 2%硼酸溶液和 2～ 3滴混合指示液，將接收瓶置于冷凝管下口，使下口浸入到硼酸接收液中。再吸取 10 mL 定容后的樣品液，沿小玻璃杯移入反應(yīng)室，并用少量的蒸餾水沖洗小玻璃杯，塞緊棒狀杯塞。向小玻璃杯中加入 20～ 30 mL40%的氫氧化鈉溶液（過量），慢慢提起棒狀杯塞，使氫氧化鈉緩慢流入反應(yīng)室（防止反應(yīng)室氣體從杯塞處 外泄），立即塞緊棒狀杯塞，并在小玻璃杯中加入蒸餾水使之密封。通入蒸汽 5 min，降低接收瓶位置使冷凝管末端離開液面后再繼續(xù)蒸餾 1 min，用少量蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液并入接收瓶，取下接收瓶。 3) 滴定。 用 mol/L 的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定接收瓶瓶中的液體，使之剛剛出現(xiàn)灰紫色即為終點，記錄所消耗 mol/L 的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（ mL）。 4) 計算。 根據(jù)所消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的體積，計算出總的氮的含量，再乘以蛋白質(zhì)中氮的轉(zhuǎn)化系數(shù)即可得到樣品中的蛋白質(zhì)的含量。即： 計算公式： )(100]0 .0 1 4c)[( 21 ???????? mFVVX 式中： X試樣的蛋白質(zhì)含量 (g/ 100mL) V1滴定樣品消耗鹽酸體積 ( mL) V2滴定空白樣消耗鹽酸體積 ( mL) c所用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸的濃度 ( mol/ L) 0. 014每毫克當(dāng)量氮的克數(shù) F食品中氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，奶制品 F 值為 m奶樣品的質(zhì)量 (g) 燕山大學(xué)本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 12 雙縮脲法測定牛奶中的蛋白質(zhì)含量 實 驗儀器及藥品