【正文】 IV 實驗數(shù)據(jù)及處理 ..........................................................................21 實驗結(jié)果及分析 ..........................................................................22 雙縮脲法的實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 ..............................................22 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計算 ..........22 標準蛋白曲線的繪制 ..................................................................22 雙縮脲法對摻雜尿素溶液的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 .....................................................................................................................23 雙縮脲法對摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 .....................................................................................................................25 考馬斯亮藍法的 實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 ......................................26 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計算 ..........26 標準蛋白曲線的繪制 ..................................................................26 考馬斯亮藍法對摻雜尿素的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 .....................................................................................................................28 考馬斯亮藍法對摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測定 .............................................................................................................29 反向高效液相色譜法的實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 ..........................30 尿素標準曲線和三聚氰胺標準曲線的繪制 ..............................30 反向高效液相色譜法測樣品中的尿素和三聚氰胺 ..................33 結(jié)論 .....................................................................................................................36 參考文獻 .............................................................................................................37 致謝 .....................................................................................................................40 附錄 1 開題報告 ................................................................................................41 附錄 2 文獻綜述 ................................................................................................44 附錄 3 中文譯文 ................................................................................................47 附錄 4 外文原文 ................................................................................................56 第 1章 緒論 1 第 1章 緒論 課題背景 隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展，人民生活水平的不斷提高，以及營養(yǎng)知識的 普及和宣傳，越來越多的人開始注重在飲食方面的質(zhì)量，越來越多的人追求營養(yǎng)的均衡發(fā)展。蛋白質(zhì)作為人類最重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一 , 是生物體細胞的重要組成成分，有許多的生物學功能。而蛋白質(zhì)又是牛奶及奶制品中的主要成分，乳蛋白中含有大量的人體必需氨基酸，是人體細胞不可缺少的，也是牛乳中最重要的特征營養(yǎng)成分，因此，作為人們攝取蛋白質(zhì)的主要來源的奶制品深受人們的青睞。牛奶中的蛋白質(zhì)含量越高，其營養(yǎng)價值就越高，因此乳及乳制品中蛋白質(zhì)含量的高低將決定產(chǎn)品的營養(yǎng)價值的高低和質(zhì)量的優(yōu)劣。 過去幾十年中，乳品經(jīng)常被用作為嬰幼兒和老弱病 殘孕的營養(yǎng)食品，到近些年，乳品已就成為多數(shù)人的生活必需品，因此，牛乳的產(chǎn)銷量在持續(xù)不斷的快速增長，同時，乳制品消費量的急劇增大也導致了奶源的嚴重不足。在這種情況下，在巨大的經(jīng)濟利益的誘惑下，一些不法商販開始在牛乳中摻雜使假，以從中謀求暴利。乳制品中的摻物的種類有很多種，如：水、米湯、豆?jié){、淀粉、蔗糖、食鹽、碳酸鈉、雙氧水、電解質(zhì)溶液、牛尿、尿素、三聚氰胺、植物油、陳乳、白礬、亞硝酸鹽、硝酸鹽、洗衣粉、抗生素、化肥等 [13]。其摻雜的方式也是多種多樣的，總結(jié)起來有以下幾種情況：摻入非蛋白成分 (尿素，三聚氰胺 ，乳脂肪，乳糖等 )以使奶制品中的蛋白氮含量增加；摻入雜蛋白 (大豆粉，明膠等 )以使奶制品中的蛋白質(zhì)的種類增加；摻入價格低廉的乳源蛋白如乳清粉等以使奶制品的成本降低；摻入其他動物乳汁以降低奶制品的成本。這種在牛乳中摻雜使假的行為不僅極大損害了廣大人民群眾的身體健康和切身利益，同時也大大降低消費者對乳品企業(yè)和乳品質(zhì)量的信任，甚至使政府在人民心目中的形象遭到破壞。例如 20xx 年的三鹿奶粉事件所造成的后果和社會影響說明，乳品質(zhì)量好壞與否不僅關(guān)系到嬰幼兒和青少年的健康成長，也關(guān)系到無數(shù)家庭的幸福、社會的和諧以及我們國家 的形象。雖然這些年來我們國家一直都在不停地打假治假，但是這種摻假造假的現(xiàn)象迄今都是禁而未止，摻雜使假的情況時不時的浮出水面，乳制品燕山大學本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 2 的質(zhì)量安全問題也已經(jīng)引起了全社會的普遍關(guān)注。 蛋白質(zhì)測定方法概述 蛋白質(zhì)是乳及乳制品中的主要成分，是牛乳中最重要的特征營養(yǎng)成分，乳及乳制品中蛋白質(zhì)含量是必測指標 [4]。因此，近年來，人們發(fā)展了許多測定蛋白質(zhì)的方法。目前蛋白質(zhì)的測定方法主要有凱氏定氮法、分光光度法、和滴定法等 [5]。其中分光光度法又包括：雙縮脲法，考馬斯亮藍法，福林 酚試劑法、 BCA 法和紫外吸收法等，滴定 法包括有甲醛滴定法、 pH 滴定法等。近些年來，色譜技術(shù)也開始用于蛋白質(zhì)含量的檢測之中。 凱氏定氮法 我國國家標準中測定食品中蛋白質(zhì) (GB/T5009． 520xx)[6]有 2 種方法 :凱氏定氮法和比色法。其中，凱氏定氮法是國家標準和國際標準中首推的蛋白質(zhì)的檢測方法。 凱氏定氮法（其裝置圖如下圖 11）的基本原理是將含氮的有機物與濃 圖 11 凱氏定氮法消化、蒸餾裝置 硫酸共同加熱 ,反應過程中樣品中的碳、氫等元素被氧化成二氧化碳和水而第 1章 緒論 3 逸出 ,有機氮轉(zhuǎn)化為氨 ,并且進一步與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，通常稱此過程為“消化”。但是這個反應進行得比較緩慢 ,通常需要加入硫酸鉀來提高反應液的沸點 ,并加入硫酸銅作為催化劑 ,以促進反應的進行 ,指示消化終點的到達。消化之后向消化液中加入濃堿，濃堿可以使消化液中的硫酸銨分解 ,游離出氨 ,水蒸氣將產(chǎn)生的氨蒸餾到一定量 一定濃度的硼酸溶液中 ,該過程被稱為“堿化蒸餾”。硼酸吸收氨后使溶液中的氫離子的濃度降低 ,用標準無機酸滴定吸收后的硼酸溶液 ,直到恢復溶液中原來氫離子濃度時為止 ,最后根據(jù)所消耗標準酸的當量數(shù)即可計算出待測物中的總氮量 ,再乘以蛋白質(zhì)系數(shù)即為蛋白質(zhì)的含量 [7]。 凱氏定氮法是測定待測樣品中總有機氮最準確的方法 ,也是各種蛋白質(zhì)含量測定方法的基礎(chǔ)。經(jīng)過科研人員的不斷研究和改進 [810],凱氏定氮法已具有應用范圍廣、靈敏度高、回收率較好、使用儀器設(shè)備簡單等優(yōu)點。但是該方法操作消耗時間長 ,消化一個樣品至少需要 2 個小時 ,完 成整個操作流程一般需要 6~7 個小時左右 ,而且在消化過程中會產(chǎn)生大量的有害氣體二氧化硫，污染工作環(huán)境 ,危害操作人員的身體健康。所以該方法一般是在實驗室通風性較好的條件下由訓練有素的人員來完成 [11]。 在我國的國家標準中，凱氏定氮法測定的是總氮的含量，因此得到的結(jié)果代表的是乳品中粗蛋白的含量；而在國際標準 (ISO， AOAC， IDF)中，先用三氯乙酸對樣品進行預處理，使蛋白質(zhì)沉淀，然后再分別對沉淀中的蛋白態(tài)氮和濾液中的非蛋白態(tài)氮進行凱氏定氮，測定的結(jié)果可真實反映乳品真蛋白的含量 [12]。 由于凱氏定氮法操作費時 ，所以學者們又研究并建立了快速檢測蛋白質(zhì)的方法，即分光光度法，下面將逐一介紹一下常用的幾種分光光度法。 雙縮脲法 (Biuret 法 ) 雙縮脲 (H2NOC－ NH－ CONH2)是兩個分子脲在 180 ℃ 左右加熱，放出一分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液 （ NaOH） 中，雙縮脲 能與銅離子（ Cu2+）作用， 生 成紫紅色絡(luò)合物（該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)式見圖 12），該反應即雙縮脲反應。 燕山大學本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 4 圖 12 紫色絡(luò)合物分子結(jié)構(gòu)式 由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應。 雙縮脲反應 是肽和蛋白質(zhì)所特有的，而為氨基酸所沒有的一種 顏色反應 。一般分子中含有兩個 氨基 甲酪基（即 肽鍵 ：CONH）的化 合物與堿性銅溶液作用，就會形成紫色或藍紫色絡(luò)合物。 具有兩個酰胺基或兩個直接相連的肽鍵，或間隔一個碳原子相連的肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物，他們也都可以發(fā)生雙縮脲反應。肽鍵是組成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)，在堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與 Cu2+作用生成紫紅色絡(luò)合物，且在一定條件下， 顏色的深淺程度與蛋白質(zhì)的含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比爾定律，即 蛋白質(zhì)濃度隨著顏色的加深而呈增加的趨勢，且成正比關(guān)系， 而顏色的變化與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關(guān)， 因此我們可以通過雙縮脲法比色的方法來測定蛋白質(zhì)的濃度，這種方法也是常用的方法之一 [13]。 雙縮脲反應主要涉及肽鍵，因此受蛋白質(zhì)特異性的影響較小。而且使用的試劑價廉易得，操作簡便，可測定的范圍為 1～ 10 mg 蛋白質(zhì)，適于精度要求不太高的蛋白質(zhì)含量的測定，能測出的蛋白質(zhì)含量須在約 mg 以上。雙縮脲法的缺點是精確度低、所需樣品量大，干擾此測定的物質(zhì)有很多。 主要的干擾有： 酚類、檸檬酸、硫酸銨、 Trsi 緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等第 1章 緒論 5 均有干擾作用 [14]。濃度較低的尿素 (%),硫酸鈉 (l%),硝酸鈉 (l%),三氯乙酸 (%),乙醇 (5%),乙醚 (5%),丙酮 (%)等溶液對顯色無影響 ,但這 些物質(zhì)濃度高時 ,必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液 ,只須加濃碳酸鈉 氫氧化鈉溶液 ,即可顯色測定。若樣品酸度較高 ,顯色后會較淺 ,則必須提高碳酸鈉 氫氧化鈉溶液的濃度 12 倍 。 福林 酚試劑法（ Lowry 法） 福林 酚試劑法（ Lowry 法）是 Lowry 在雙縮脲方法的基礎(chǔ)上發(fā)展的。Lowry 確定了使用該方法測定蛋白質(zhì)濃度的基本步驟 ,他在雙縮脲試劑的基礎(chǔ)上又增加了一種增強顯色的試劑 —— 磷鉬酸和磷鎢酸的混合液 ,蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的酚羥基會將它們還原，從而產(chǎn)生深藍色 (鉬藍和鎢藍的混合物 ),增加顯色量 ,這樣就提高 了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度。 Lowry 法是最靈敏的蛋白質(zhì)測定方法之一 ,該法在生物化學領(lǐng)域得到廣泛的應用 。 （ 1） 實驗原理 福林 酚試劑法的顯色原理是在雙縮脲法的基礎(chǔ)上 [12],加入了第二種試劑 —— 福林 酚試劑 ,增加了顯色量 ,從而達到了提高了檢測蛋白質(zhì)的靈敏度的效果。這兩種顯色反應產(chǎn)生深藍色的原因是 :在堿性環(huán)境中 ,蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子結(jié)合生成復合物；福林 酚試劑中的磷鋁酸鹽 磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原 ,產(chǎn)生深藍色 (鋁藍和鎢藍的混合物 )。Lowry 法中的樣品的吸光度取決于一