基因表達(dá)與蛋白質(zhì)純化技術(shù)探討(ppt40)-食品飲料-資料下載頁
2025-08-06 12:33本頁面
【導(dǎo)讀】基因表達(dá)體系及優(yōu)劣勢。大腸桿菌中表達(dá)蛋白質(zhì)。遺傳背景清楚，基因工程操。類齊全，表達(dá)效率高；基本不分泌，易形成包含體。分泌蛋白質(zhì)能力強，一般有天然。無加糖修飾功能，培養(yǎng)液中蛋白。質(zhì)粒不穩(wěn)定，尚無商品化的表達(dá)。可生產(chǎn)分泌型蛋白；有天然立體結(jié)構(gòu)，糖鏈與哺乳動物加工的不一致，培養(yǎng)上?？梢圆《靖腥镜男褪皆诔上x中生產(chǎn)，糖鏈有所區(qū)別，表達(dá)量有限；作為藥物宿主細(xì)胞未被FDA認(rèn)可。體蛋白質(zhì)完全一致；植物可大面積種植，可以廉。轉(zhuǎn)基因植物制作費時，表達(dá)。表達(dá)量較難提高，分離純化。轉(zhuǎn)基因動物制作花費巨大，實驗成本低，飼養(yǎng)費用低；加糖方式可能與人有所不同。在大腸桿菌中直接生產(chǎn)有活性的胰島素。在大腸桿菌生產(chǎn)Calcitonin類C端酰胺化短肽。在雞輸卵管中進(jìn)行與哺乳動物細(xì)胞一致的糖基化。提高乳腺分泌表達(dá)的FactorIX類因子的活性。lac及衍生的tac,trc,pac,rac等啟動子IPTG誘導(dǎo)。lamdaphagePL和PR啟動子熱誘導(dǎo)。Thioredoxin**幫助二硫鍵形成。物素化的位點.Promega的PinPointTMXa-1;
【正文】 簡單 。 但費時 , 費緩沖液 , 蛋白質(zhì)濃度不能過高 (容易產(chǎn)生沉淀 ) ? 快速稀釋法 : 最常用的小規(guī)模復(fù)性方法 。 但比較費時 ,費緩沖液 , 蛋白質(zhì)的濃度不能高 (容易產(chǎn)生沉淀 ) ? 超濾透析法 : 比較省緩沖液 , 處理量大 。 但費時 , 要控制好蛋白質(zhì)濃度 ? 凝膠過濾法 : 快速 , 可重復(fù)性高 , 不會產(chǎn)生沉淀 , 操作復(fù)雜一點 ? 親和層析復(fù)性法 , 水相二相法 , etc 包含體來源蛋白質(zhì)的復(fù)性 來自 庫下載 ? 表達(dá)量不夠高； ? 包含體在 8M尿素中不能溶解； ? 重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的分子量偏小； ? 帶 Histag重組蛋白不吸附到 Nichelating樹脂上； ? Nichelating分離純化的效果不好； ? GST融合蛋白不吸附到 glutathioneSepharose上； ? 包含體來源的采用透析法或稀釋法復(fù)性時全部沉淀； ? Nichelating錯用 DTT后發(fā)生黑色沉淀該怎么辦？ ? 貴重的親和層析樹脂經(jīng)常發(fā)生結(jié)塊該怎么辦？ ? 某些表達(dá)載體的表達(dá)效率在放大培養(yǎng)時無法提高 經(jīng)常碰到的問題 來自 庫下載 嘗試不同表達(dá)載體， 特別是 N端有融合蛋白的載體 來自 庫下載 ?是不是忘了加還原劑（ DTT或巰基乙醇）？ ?是不是在－ 20℃ 凍存過？ ?用 4M鹽酸胍試試 來自 庫下載 ? 是不是酸性蛋白質(zhì)？ ? 是不是蛋白質(zhì)的合成提前中止了？ （富含 Arg, Ile, Leu, Pro這幾種氨基酸） ? 可以嘗試用 BL21 CodonPlus RIL 或 RP 作宿主菌 (Stratagen)； ? 使用 C端帶 Histag的融合表達(dá)載體（如pET21, Novagen）以便純化全長的融合蛋白 來自 庫下載 ?Histag被操作過程混入的重金屬離子所飽和，可以通過添加 mM EDTA來去除重金屬離子的干擾； ?Histag被包裹在不易和樹脂發(fā)生結(jié)合的 位置（比較罕見） 。 ?其他不明原因?qū)е氯踅Y(jié)合 來自 庫下載 ? 樣品沒有很好細(xì)心去除不溶性物質(zhì) ? 重復(fù)使用前樹脂沒有洗干凈 ?蛋白質(zhì)之間存在相互作用 ? 可以提高鹽濃度 , 改變 pH, 添加 26 M尿素等方法來洗去雜蛋白質(zhì) 來自 庫下載 是不是在進(jìn)行復(fù)性時用了 Redox buffer 來自 庫下載 嘗試用 Urea gradient / Gel filtration來解決 來自 庫下載 盡快用 N HCl沖洗 來自 庫下載 用 N NaOH / % SDS洗 來自 庫下載 主要是溶氧量的問題 , 可以通過在搖瓶中加入不同量的培養(yǎng)基的方式來確定最佳體積
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