【文章內容簡介】 1~2 層。 C 級：裸卵或卵丘細胞雖為 1~2 層或多層，但是不完整，部分裸露。 A 級卵母細胞的培養(yǎng)效果要優(yōu)于 B 級和 C 級。 目前，常用的采集豬卵母細胞的方法有三種即抽吸法、切割法和刺破法，相對于刺破法和切割法而言，抽吸法較為常用，但是所獲得的卵母細胞質量較差，甚至出現(xiàn)較多的裸卵，進而間接地影響了體外培養(yǎng)的效果。 卵母細胞體外成熟的物理性因素 體外成熟培養(yǎng)條件 燕 山 大 學 課 程 設 計 說 明 書 4 溫度 不同動物的卵母細胞所需要的體外成熟培養(yǎng)溫度因動物種類的不同而不同，豬所需要的溫度一般為 38℃ ~39℃較為適宜，過高或過低都不利于細胞的發(fā)育。 濕度 在 IVM 時一般采用的是飽和濕度，目的是減少培養(yǎng)基內的水分蒸發(fā)，從而維持培養(yǎng)基中卵母細胞所需要的各種物質的濃度及保持滲透壓。通常在培養(yǎng)基上面覆蓋一層石蠟油或礦物油，以使在培養(yǎng)箱內或離箱操作時維持培養(yǎng)基的氣相、濕度與 pH 值。此外，培養(yǎng)箱所用的水的純度和高度無菌也是培養(yǎng)成功的關鍵性因素。 氣相環(huán)境 目前卵母細胞常用的培養(yǎng)氣相有兩種即是 5%CO 5%O90%N2和 5%CO 95%的空氣 [xxxii]。在這兩種氣相中， CO2 的含量很關鍵。多數(shù)培養(yǎng)基在配制前都已將 pH 值調好，并具有一定的緩沖能力，因此， 5%CO2 則剛好是維持 pH 所必需。另外，要保證所用氣體的無毒。 不同動物的卵母細胞所需要的體外成熟培養(yǎng)時間因動物種類的不同而有所不同，大多數(shù)哺乳動物所需要的體外培養(yǎng)時間為 22~24h，但是對豬而言，卻需要更長的時間，一般，豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的時間為 44h。 Sosnowki 等研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng) 40~48 h 與 30~36 h 對豬卵母細胞體外成熟率差異顯著，但是分析染色體核型發(fā)現(xiàn)，隨著體外培養(yǎng)時間的延長，染色體異常率會隨之增加。 目前，常用的豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)方式有微滴培養(yǎng)法、套皿培養(yǎng)法及普通的單皿培養(yǎng)法。相對于普通的單皿培養(yǎng)法而言，微滴培養(yǎng)法和套皿培養(yǎng)法可以更好的保持細胞發(fā)育所需要的微環(huán)境，同時減少微生物的污染。李俊等研究認為在豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中，套皿培養(yǎng)法可以代替微滴培養(yǎng)法中礦物油的作用，從而可以減少礦物油對細胞的危害。 成熟基礎液的構成 ,直接影響到卵母細胞的成熟率及以后的受精和胚胎發(fā)育。豬卵母細胞的 IVM 液有 Whitten39。s medium， NCSU23， TCM199NCSU37。目前豬卵母細胞體外培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)液以 TCM199和 NCSU23使用較多。成熟燕 山 大 學 課 程 設 計 說 明 書 5 培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)液不同卵母細胞成熟后 GSH 的含量存在顯著差異， IVF后雄原核形成率也不同。 Wang等人的研究顯示在 NCSU23 中成熟的卵母細胞 IVF 后囊胚發(fā)育率顯著高于在 TCM199 和改良 Whitten39。s 液中 Lalantha等人認為在不添加蛋白質添加物的情況下 TCM199 更有利于卵母細胞的核成熟，而在Waymouth基礎液中成熟的卵母細胞其核成熟率雄原核形成率和囊胚發(fā)育率較低。王海等研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞在兩種培養(yǎng)液中的成熟率差異不顯著。但葉華虎等研究發(fā)現(xiàn)，受精后胚胎發(fā)育能力 NCSU23占明顯優(yōu)勢。 在卵母細胞的體外培養(yǎng)體系中， FSH、 LH 有利于改變卵丘細胞的代謝機能，并阻斷卵丘細胞通過胞間連接向卵母細胞分泌減數(shù)分裂抑制因子的途徑，從而使卵母細胞恢復成熟分裂過程 。在豬卵 母細胞體外成熟研究中，許多學者都選擇添加 PMSG,有人還認為添加 PMSG 和 hCG 的組合對豬卵母細胞核成熟的促進作用優(yōu)于添加 FSH 和 LH。尤其對于 LH 的添加存在爭議，有研究者認為 LH 在卵母細胞培育過程中并未發(fā)揮作用， Izadyar 等認為在不含血清的成熟培養(yǎng)液中，只有 FSH 能影響卵母細胞的成熟，而 LH 沒有作用；Bevers 等認為小于 8mm 的牛卵泡中，顆粒細胞上只有 FSH 受體 mRNA，而沒有 LH 受體 mRNA。但彭禮繁等卻認為 LH 對豬卵母細胞體外成熟的促進效果要強于 FSH。 在早期的研究中 ，促性腺激素多數(shù)存在于整個體外培養(yǎng)過程，但 1994 年，F(xiàn)unashi 等的研究表明，在豬卵母細胞 IVM 時，培養(yǎng)前 20 h 加入 PMSG、 hCG、E2，而在培養(yǎng)后 20 h 去除，可增加卵母細胞的成熟率，同時可以促進卵母細胞減數(shù)分裂和胞質的成熟，而且有利于卵母細胞的發(fā)育和受精。蔡令波等在培養(yǎng)后期去除促性腺激素也得出了相似結果。 自 20 世紀 80 年代血清應用于卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)以來，血清在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)并利用，血清中含有許多成分包括能量物質、氨基酸、維生素、激素、生長因子和細胞因子等等能夠促進原始卵泡卵母細胞生長啟動，并提供生長所需的一種或幾種因子，因而，培養(yǎng)液中添加動物血清可促進卵母細胞成熟。在豬卵母細胞體外培養(yǎng)中，用得最廣泛的是在成燕 山 大 學 課 程 設 計 說 明 書 6 熟培養(yǎng)液中添加 10%的胎牛血清（ Fetal bovine serum， FBS）。蔡令波等曾研究表明發(fā)情牛血清（ Estrus cows serum， ECS）較新生犢牛血清（ Newborn Calf Serum， NCS）更有利于豬卵母細胞體外成熟。近年來，許多研究者又在豬的卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加一定比例的豬血清，其中包括 :新生仔豬血清，母豬發(fā)情的血清等。 雖然血清對于豬卵母細胞的體外培養(yǎng)有較好的促進作用，但是血清也有其本身固有的不利因素，如血清中所含有的激素、維生素、細胞因子、生長因子，以及許多未知物質，并且容易被支原體感染。此外血清的來源不同、批次不同均會導致血清中所含組分及組分間比例不同，從而導致了卵母細胞體外成熟、體外受精和體外培養(yǎng)的不穩(wěn)定。因此，尋找比較適宜的血清替代品成為當前的一大研究 熱點，目前用來代替血清的替代品有牛血清白蛋白 (Bovine SerumAlbumin ， BSA) 、聚乙烯醇 (Polyvinyl Alcohol ， PVA) 、聚乙烯毗咯烷酮 (polyvinylpyrrolidone， PVP)等大分子有機物質。 豬卵泡液 (pig follicular fluid， pFF)是豬卵母細胞發(fā)育的微環(huán)境，對卵母細胞的成熟有著重要的調節(jié)作用，主要表現(xiàn)在提高豬卵母細胞成熟的質量并增加胚胎的發(fā)育能力。 Naito 等 [xlv]的研究認為：在體外成熟培養(yǎng)中， PFF 可以 促進豬卵母細胞胞質的成熟，并顯著提高豬卵母細胞受精后的原核形成率。Yashida 等報道在成熟培養(yǎng)基中添加豬卵泡液可顯著提高豬卵母細胞的核成熟率、正常受精率及卵裂率。 Vatzias 等研究發(fā)現(xiàn)冷凍卵泡液在促進卵母細胞的成熟、降低多精受精方面優(yōu)于新鮮卵泡液，孟慶剛等認為在激素存在的條件下， pFF 具有促進豬小腔卵泡卵母細胞體外成熟的作用。 與卵母細胞體外成熟相關的細胞生長因子主要包括表皮生長因子(Epidermal growth factor， EGF)，胰島素樣生長因子 (insulinlike growth factors，IGF)、成纖維細胞生長因子 (Fibroblast Growth Factor， FGF)、轉化生長因子(transforming growth factor， TGF )及神經(jīng)生長因子 (nerve growth factor， NGF)等，這些細胞生長因子之間相互作用，對卵母細胞的成熟、受精與卵裂起著重要作用。 燕 山 大 學 課 程 設 計 說 明 書 7 目前已經(jīng)證實， EGF 可以促進豬卵母細胞的核成熟。 Abeydeera 的研究表明， EGF 能提高卵母細胞成熟過程中蛋白質的合成，從而提高卵母細胞胞質的質量， IGF 對細胞具有促分裂、分化及促代謝等生物學功能，是一個具有多種生理功能的生長因子，因此，同樣能促進豬卵母細胞的成熟，并能提高所得胚胎的發(fā)育能力。 TGFα，在結構上和功能上與 EGF 相似，因而也可以與EGF受體結合，誘導豬卵丘細胞的擴散，促進卵母細胞核成熟。 NGF 也是豬卵母細胞體外成熟過程中重要的調節(jié)物質之一，能影響豬卵母細胞成熟的動力學，加快進入 M11 期。 卵母細胞的體外成熟可以為細胞核移植、轉基因等胚胎工程的研究提供大量卵母細胞。在排卵前，由于促性腺激素的作用， 卵母細胞完成減數(shù)分裂的同時，卵丘卵母細胞復合物（ 4C4D）的卵丘發(fā)生擴展， 4C4D在體外成熟培養(yǎng)過程中也發(fā)生類似的變化。卵丘細胞與卵母細胞、卵丘擴展與卵母細胞成熟之間的關系很復雜。本文主要對卵丘細胞在卵母細胞體外成熟培養(yǎng)過程中的作用加以闡述，進而對卵母細胞的體外成熟培養(yǎng)加以改進。 卵丘細胞與卵母細胞在卵母細胞成熟過程中的結構與功能聯(lián)系 卵母細胞的發(fā)育成熟與其周圍的卵泡細胞的作用是分不開的。原始卵泡由位于中心的卵母細胞和其周圍的一層扁平卵泡細胞組成。此時卵母細胞處于第一次減數(shù)分裂前期，以后隨著卵母細胞 開始生長，卵泡細胞迅速增殖，由單層變?yōu)槎鄬?。在這些卵泡細胞內，線粒體和粗面內質網(wǎng)豐富。 卵泡細胞和卵母細胞伸出突起