【文章內(nèi)容簡介】 牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待細胞生長至完全融合后48 h開始誘導分化。將原培養(yǎng)液換成含115 ng/ml 3異丁基1甲基黃磦呤（IBMX）、1μmol地塞米松和10μg/ml胰島素的完全培養(yǎng)液。細胞孵育48h后，撤去IBMX和地塞米松，使培養(yǎng)液中只含有胰島素10μg/ml。再孵育48 h后，撤去胰島素，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，每48 h換液一次，直到95%的細胞都為成熟的脂肪細胞。誘導分化時間約1周。②肥大脂肪細胞誘導分化：脂肪細胞促分化至第21天，即為肥大脂肪細胞。（方法參考：Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005。25:20628.） ③ 兩種脂肪細胞的膽固醇代謝率比較（膽固醇代謝實驗）：1) 按（1）、（2）所述方法，將3T3 Ll前體脂肪細胞分別誘導分化為成熟脂肪細胞和肥大脂肪細胞。2) 用含acLDL 50mg/L的10% LPDSDMEM誘導48 h后， Ci/ml [3H]標記的膽固醇（[3H]膽固醇）107Bq/L繼續(xù)孵育24 h，收集培養(yǎng)液并離心，γ射線計數(shù)儀測定放射活性，即為培養(yǎng)液的[3H]膽固醇放射活性，計算細胞膽固醇流出率，為培養(yǎng)液的[3H]膽固醇放射活性占總放射活性的百分比。3) PBS漂洗細胞， mol/L NaOH 1ml反復凍融3次裂解細胞，收集溶解后的細胞用γ射線計數(shù)儀測定放射活性，即為細胞所攝取的膽固醇的量，該值所占總放射活性的百分比，為細胞膽固醇攝取率。4) 比較兩組細胞的細胞膽固醇流出率和攝取率，可知兩種脂肪細胞的膽固醇代謝率差異。5) 比較兩組細胞的膽固醇代謝相關因子表達差異：按照步驟3) 裂解細胞，抽提細胞RNA及其蛋白，分別通過RTPCR和Western Blotting，測定細胞中膽固醇攝取相關因子（如LDLRLDL受體相關蛋白、小窩蛋白caveolin、PPARα、PPARγ）和膽固醇流出相關因子（如ABCAABCGSRBI、LXRα）的基因和蛋白表達水平，以明確兩種脂肪細胞的膽固醇代謝差異的機制（圖1）。3T3 Ll前體脂肪細胞三周一周誘導分化比較兩組細胞的膽固醇代謝相關信號表達差異比較兩組細胞的膽固醇代謝率差異肥大脂肪細胞成熟脂肪細胞膽固醇代謝實驗 圖1（2）肥大脂肪細胞膽固醇失衡的分子機制探討1）利用siRNA技術，分別構建LXR和SREBP2的siRNA腺病毒載體，分別轉染人成熟脂肪細胞和肥大脂肪細胞中；不同時間點檢測LXR和SREBP2的表達，明確基因沉默效果；2）合適的時間點（根據(jù)上一步確定的時間點）檢測脂肪細胞內(nèi)膽固醇的代謝率以及膽固醇代謝相關因子表達，以明確LXR和SREBP2在脂肪細胞膽固醇代謝失衡中的作用。第二部分 膽固醇負荷對脂肪細胞內(nèi)質網(wǎng)應激和內(nèi)分泌功能的影響及機制探討（1） 膽固醇過負荷對脂肪細胞內(nèi)質網(wǎng)應激及分泌功能的影響及其機制1）在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)小鼠3T3L1前脂肪細胞；2）培養(yǎng)3T3L1前體脂肪細胞，促分化為成熟的脂肪細胞；3）用AcLDL及ACAT抑制劑處理脂肪細胞，使之為膽固醇過負荷的脂肪細胞；4） 在AcLDL及ACAT抑制劑的基礎上應用U18666A，抑制膽固醇向內(nèi)質網(wǎng)轉運；5）干預結束后用測定脂肪細胞膽固醇含量，分離內(nèi)質網(wǎng)并測定內(nèi)質網(wǎng)膽固醇含量；Western Blot法檢測脂肪細胞GRP78/Bip、XBP1及磷酸化 PERK與eIF2α的蛋白水平，評價是否誘導產(chǎn)生內(nèi)質網(wǎng)應激；用定量RTPCR法檢測各種脂肪因子的mRNA表達，用ELISA法測定上清液脂肪因子的分泌；檢測脂肪細胞IKK/NFκB通路活性，包括用Western Blot法測定胞漿蛋白IκB及磷酸化IKK、核蛋白NFκB表達水平，并用EMSA法測定NFκB活性（圖2）。6）構建腺病毒載體，轉染入脂肪細胞，siRNA沉默NFκB p65后，再次重復上述實驗。（2） 肥胖小鼠脂肪細胞膽固醇負荷、內(nèi)質網(wǎng)應激、脂肪因子表達分泌情況及活性蛋白伴侶的作用探討1）建立兩種肥胖小鼠模型：遺傳性ob/ob肥胖小鼠及飲食誘導的C57BL/6營養(yǎng)性肥胖小鼠，并設正常C57BL/6小鼠為對照；2）將各組小鼠分別予以口服活性化學蛋白伴侶PBA和TUDCA共3周，并設立對照；3）測定血糖、血脂及血清脂肪因子濃度；4）麻醉處死動物，留取脂肪組織，分離成熟脂肪細胞并體外孵育培養(yǎng)24小時，檢測各組脂肪細胞體積大小；測定脂肪細胞膽固醇含量，分離內(nèi)質網(wǎng)并測定內(nèi)質網(wǎng)膽固醇含量；檢測脂肪因子的mRNA表達并測定上清液脂肪因子的分泌水平；用Western Blot法測定脂肪細胞GRP78/Bip、XBP1及磷酸化 PERK與eIF2α的蛋白水平；測定脂肪細胞IKK/NFκB通路的活性（圖3）。 小鼠3T3L1前脂肪細胞，誘導分化8天成熟AcLDL＋ ACAT抑制劑AcLDL＋ ACAT抑制劑＋U18666A對照組干預結束，收集細胞及上清液檢測脂肪因子mRNA表達及上清液脂肪因子濃度Western Blot法測定胞漿蛋白IκB及磷酸化IKK、核蛋白NFκB表達水平，用EMSA法測定NFκB活性。測定細胞內(nèi)及內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)膽固醇含量Western Blot法檢測脂肪細胞GRP78/Bip、XBP1及磷酸化 PERK與eIF2α的蛋白水平 圖2 正常C57BL/6小鼠C57BL/6營養(yǎng)性肥胖小鼠ob/ob肥胖小鼠TUDCA干預PBA干預對照組取脂肪組織，分離成熟脂肪細胞并體外孵育24小時測定血糖、血脂及血清脂肪因子濃度Western Blot法測定胞漿蛋白IκB及磷酸化IKK、核蛋白NFκB表達水平，用EMSA法測定NFκB活性Western Blot法檢測脂肪細胞GRP78/Bip、XBP1及磷酸化 PERK與eIF2α的蛋白水平檢測脂肪因子mRNA表達及上清液脂肪因子濃度測定各組脂肪細胞體積大小及內(nèi)質網(wǎng)膽固醇含量 圖3 第三部分 脂肪細胞因子影響肝臟HDL代謝（1） 觀察 體外脂肪細胞/肝細胞共培養(yǎng)對肝細胞HDL代謝相關蛋白的影響1) 通過脂肪細胞與肝細胞共培養(yǎng)，比較不同分化程度（未分化、成熟和肥大）和應激狀態(tài)（oxLDL負荷和Fas配體刺激）的脂肪細胞對肝細胞LXRa、ApoAI、ABCA1及SRBI蛋白及mRNA表達的影響。同時觀察不同脂肪細胞對肝細胞攝取HDL中膽固醇的差異。2) 比較不同脂肪細胞共培養(yǎng)下培養(yǎng)液介導巨噬細胞膽固醇流出能力的差異。（2） 觀察體內(nèi)脂肪組織對基質膠皮下種植肝細胞的HDL代謝相關蛋白的影響采用基質膠注射和回收模型，將肝細胞懸浮于基質膠中注射到腹部皮下脂肪周圍，比較肥胖與非肥胖小鼠對基質膠種植的肝細胞LXRa、ApoAI、ABCA及SRBI蛋白及mRNA表達的影響。（3） 探討 脂肪細胞對肝細胞HDL代謝影響的相關通路和分子機制1) 通過siRNA沉默脂肪細胞JNK1及Fas基因后，觀察延長分化（誘導肥大脂肪細胞）、膽固醇負荷及FasL刺激的脂肪細胞共培養(yǎng)對肝細胞LXRa、ApoAI、ABCA及SRBI蛋白及mRNA表達的影響及肝細胞對HDL中膽固醇攝取的影響。2) 在脂肪細胞肝細胞共培養(yǎng)時，加入不同脂肪因子中和抗體（如ILTNFa及瘦素抗體），觀察其對肝細胞LXRa、ApoAI、ABCA及SRBI蛋白及mRNA表達的影響及其對肝細胞攝取HDL中膽固醇的影響。(3) 在脂肪細胞/肝細胞共培養(yǎng)時，加入NFkb拮抗劑，阻斷肝細胞的NFkb通路，觀察其對肝細胞LXRa、ApoAI、ABCA及SRBI蛋白及mRNA表達的影響及肝細胞對HDL中膽固醇攝取的影響。（4） 體內(nèi)驗證脂肪細胞因子對肝細胞HDL代謝影響1) 觀察對照與肥胖小鼠（基因敲除和飲食誘導）肝臟LXRa、ApoAI、ABCA及SRBI蛋白及mRNA表達差異及血清ApoAI和HDLC水平差異，同時觀察體內(nèi)注射不同脂肪因子中和抗體（如ILTNFa及瘦素抗體）后肥胖小鼠肝臟LXRa、ApoAI、ABCA及SRBI蛋白及mRNA表達及血清ApoAI和HDLC水平變化。2) 觀察體內(nèi)注射不同脂肪因子中和抗體（如ILTNFa及瘦素抗體）對肥胖小鼠體內(nèi)膽固醇逆轉運各環(huán)節(jié)（從巨噬細胞到血清以及從血清到糞便）的影響。第四部分 脂肪細胞因子影響肝臟TG代謝（1）肝細胞與脂肪細胞共培養(yǎng)對肝細胞脂質蓄積的影響1) 建立脂肪細胞與肝細胞的共培養(yǎng)模型，檢測肝細胞內(nèi)TG含量 2) 肝細胞與脂肪細胞共培養(yǎng)后，檢測肝細胞PPAR