鎂離子濃度對細胞融合效果的影響(編輯修改稿)
2025-06-12 08:32 本頁面
【文章內容簡介】 。PEG細胞融合法也有很多影響因素：如PEG分子量與濃度，PEG的PH值，融合時的溫度和PEG的處理時間[4]等等。然而，目前關于PEG法誘導細胞融合的影響因素的研究還不夠全面，關于配方優(yōu)化的詳細報道也不多，需要我們來做更多的實驗來研究。從離子濃度展開研究是提供細胞融合改進方案的新思路，具有很重要的意義。為此我們以雞紅血細胞為材料，探討了Mg2+濃度對細胞融合的影響，以期確定獲得較高細胞融合率的各項指標的數(shù)據(jù)范圍，進一步擴寬PEG誘導細胞融合的應用范圍。1材料與方法 實驗材料 試劑公雞靜脈血，檸檬酸鈉，PEG（MW=6,000），MgSO4（國藥集團）， %生理鹽水，Hanks溶液，Janus green B 染液（Solarbio 公司）。Hanks 緩沖液配方： 甲液：NaCl g ，KCl g，MgSO47H2O g，MgCl26H2O g， mL，CaCl2（無水），蒸餾水 mL將兩種液體混合后，加水至 mL，濾紙過濾， ℃； 乙液：Na2HPO412H2O ， g，葡萄糖 ， mL，濾紙過濾，加入 % 酚紅 mL，加水至 mL， ℃。 甲乙液各1 份，蒸餾水18 份，用 %NaHCO3調節(jié) pH至 。 電子天平，恒溫水浴鍋，血球計數(shù)板，低速離心機，光學顯微鏡，試管架，注射器，載玻片，離心管?！∮脺缇淖⑸淦魑?8 g/L的檸檬酸鈉2ml，從用75%酒精消過毒的雞翼靜脈處采取靜脈血轉入事先裝有38g/L的檸檬酸鈉的燒杯中使檸檬酸鈉與血液的體積比為1：4，放入4℃冰箱中保存，可使用3到4天。 50%PEG的配制用MgSO4調節(jié)Hanks 溶液 Mg2+離子濃度分別為：10 mmol/L，20 mmol/L，30 mmol/L，40 mmol/L，50 mmol/L，60 mmol/L，70 mmol/L，80mmol/L，90mmol/L；Hanks 原液作為CK對照管；共10種只有Mg2+含量不同的 Hanks緩沖液。稱取 g PEG （MW=6,000）放入試管內，在酒精燈上融化，迅速加入 mL 預熱的 Hanks 緩沖液混勻制成 50 % PEG 溶液，放入 37 ℃水浴中待用。 取新鮮雞血，1000rpm離心5min，去上清液后加入 %生理鹽水，用血球板計數(shù)法和梯度稀釋方法調節(jié)細胞濃度為 105/ml；將雞紅細胞懸液 mL放入離心管中，分別加入5 mL上述10種 Hanks緩沖液液混勻，然后以1000 rpm離心5 min，棄上清，將細胞團塊彈散。然后分別滴加10種 50%PEG的細胞融合液 ，混勻，37℃水浴中靜置 30 min 進行融合。融合完成后，緩慢滴加 相應 Hanks 緩沖液以終止 PEG 的作用，在37℃水浴內靜置5分鐘。以 1000rpm，離心 5 min，棄上清，保留下液。隨機計數(shù)顯微鏡幾個視野內1000個細胞,分別計數(shù)其中已發(fā)生融合的細胞核、未融合細胞核數(shù),計算融合細胞核數(shù)占細胞核總數(shù)之百分比即融合率[5,6,7]。其公式如下:融合率=融合細胞核數(shù)/總細胞核數(shù) 100% 取細胞懸液1~2滴依次制成臨時制片，以Janus green B 染色3min，在普通光學顯微鏡下觀察細胞融合的過程[8]。2結果通常細胞膜有內外兩層，細胞融合首先發(fā)生在外層，然后再到內層，由此就出現(xiàn)了兩種融合通道，細胞體內物質通過這兩種通道轉移。在照片中的細胞形態(tài)是呈現(xiàn)有一個共同的膜包被，通過染液染色后，可以很清楚的看到兩個或多個細胞核存在
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