20xx年醫(yī)學專題—第4講細胞融合與體細胞雜交(編輯修改稿)
2024-11-16 00:28 本頁面
【文章內容簡介】 0。)某一濃度梯度，用吸管收集,液體培養(yǎng)基或甘露醇懸浮洗滌原生質體23次,將原生質體懸浮在液體培養(yǎng)基中備用,第二十三頁，共七十一頁。,24,葉片原生質體分離純化流程圖,第二十四頁，共七十一頁。,（2）鑒定與活力分析 低滲爆破(b224。op242。)法：爆破后是無形的。滲透壓調節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 染色法：有活力的原生質體吸收不同染料顯示與死亡細胞不同的顏色來分析。FDA（二乙酸熒光素）能自由地穿越細胞質膜，在活細胞內，FDA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過質膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過具熒光的細胞的觀察確定細胞活性,25,第二十五頁，共七十一頁。,26,酚藏花紅(huāh243。ng)染色法（0.1%) 酚藏花紅能使無活力的原生質體染成紅色，有活力的原生質體不著色。,伊凡藍(Evan’s blue)染色法(0.025%) 有活力但受損傷的細胞和死細胞能夠攝取這種染料，活細胞不攝取。 氧電極法：有活力原生質體光照下放出(f224。nɡ chū)氧氣，黑暗耗氧氣,第二十六頁，共七十一頁。,關鍵(guānji224。n)：細胞核的融合,27,第二十七頁，共七十一頁。,五 細胞融合方法(fāngfǎ),1.生物法 病毒誘導細胞融合：研究最早的細胞融合誘導方法。主要是由于病毒會與宿主細胞膜直接融合，同時進入兩個細胞就會打破兩個細胞膜的隔閡，引發(fā)細胞質的交流，進而達到細胞融合的目的。 原因可能是病毒的磷脂外衣與動物細胞膜相似，病毒外殼上的某些糖蛋白有促進細胞融合的功能。 仙臺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙臺病毒（HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質的復合體。因HAJ病毒毒力弱，易被滅活而常采用。 缺點：要提前大量培養(yǎng)病毒，并且滅活后才能作為融合劑使用，操作繁瑣，而且一旦滅活不充分的話，病毒還可能感染操作者與親本細胞。因此，目前已經(yǐ jing)很少使用病毒誘導法進行細胞融合。,28,第二十八頁，共七十一頁。,原理(yu225。nlǐ)與過程,（1）足夠量的病毒顆粒(kēl236。)附著在細胞膜上起搭橋作用，使細胞聚集在一起。 （2）通過病毒與原生質體或細胞膜的作用使兩個細胞膜間互相滲透，胞質互相融合。粘結部位質膜被破壞，不同細胞間形成通道，細胞質流通并融合（病毒也隨之進入細胞質）。 （3）有絲分裂，細胞核融合，形成雜種細胞。,29,第二十九頁，共七十一頁。,2 化學法,可以采用(cǎiy242。ng)的化學誘導劑包括： NaNO高pH的高濃度Ca2+離子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明膠、抗體、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。 細胞膜電荷平衡被打破。,30,第三十頁，共七十一頁。,（1）NaNO3誘導(y242。udǎo)融合,1909年，凱斯特（Kuster）發(fā)現機械分離的發(fā)生了質壁分離的洋蔥表皮細胞原生質體在NaNO3溶液中可以恢復并伴隨著細胞融合。 1972年，卡爾森（Carlson）利用NaNO3誘導融合了粉蘭煙草和郎氏煙草原生質體，培育出世界第一株體細胞雜種。 NaNO3的鈉離子可以中和原生質體表面負電荷，引起原生質體聚集，促進細胞融合。NaNO3對原生質體無損害(sǔnh224。i)，但融合效率低，一般小于4%。,31,第三十一頁，共七十一頁。,（2）高pH的高濃度Ca2+離子(l237。zǐ)誘導融合,1973年，凱勒（Keller）和梅爾切斯（Melchers）發(fā)現采用強堿性（例如pH10.5）的高濃度鈣離子(l237。zǐ)溶液（50mmol/L CaCl2?2H2O）在37℃下處理兩個品系的煙草葉肉原生質體，很容易促使融合，融合率可以達到10%。 鈣離子中和原生質體膜或細胞膜表明表面電荷，使彼此緊密接觸，決定質膜的穩(wěn)定性和可塑性；高pH能改變質膜的表面電荷，利于細胞融合。,32
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