【正文】 德國(guó) Eppendorf 自動(dòng)數(shù)字天平 AD EK120A 液氮罐 TaylarWharton 藥品 藥品 廠商 TCM199 GIBCO Hepes SIGMA FCS SIGMA FSH 寧波市激素制品有限公司 LH 寧波市激素制品有限公司 PFF 自制 青霉素 大連美羅大藥廠 鏈霉素 大連美羅大藥廠 蔗糖 上海生物優(yōu)先公司 Gly SIGMA DMSO SIGMA 細(xì)管 北京耀北生物技術(shù)公司 四孔板 北京耀北生物技術(shù)公司 卵母細(xì)胞復(fù)合體 (COCs)的收集 從屠宰場(chǎng)收集卵巢后，放入 35℃雙抗 生理鹽水中，用保溫瓶在 3 h 內(nèi)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室 ， 去除血污。本研究主要目的有兩點(diǎn)：第一，深入探討卵丘細(xì)胞支持卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的作用機(jī)制；第二，通過(guò)改善體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)，最大限度的提高裸卵的體外成熟及發(fā)育能力，為生發(fā)泡移植和 GV期卵母細(xì)胞冷凍保存等技術(shù)提供有效的裸卵成熟方法。目前認(rèn)為，這可能是由于體外成熟的卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟不充分造成的。 (2) 去除卵丘細(xì)胞的小鼠卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中線粒體由簇狀分布逐漸變?yōu)樯⒉加诼奄|(zhì)內(nèi)，該過(guò)程與卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體成熟過(guò)程中線粒體變化規(guī)律相符。對(duì)于卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞聯(lián)系的內(nèi)在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。結(jié)果還表明，卵泡直徑與卵丘細(xì)胞多少具有相關(guān)性，卵泡越大，多卵丘細(xì)胞卵所占的比率越高 ［ 11］ 。 李榮鳳等實(shí)驗(yàn)，以皮層顆粒（ CG）單層分布于質(zhì)膜下做為卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的指標(biāo)，分別于成熟培養(yǎng)前后觀察各類卵子的 CG分布情況。目前的研究中，回收的大部分卵母細(xì)胞都有完整的卵丘細(xì)胞包圍（致密或分散）。卵丘擴(kuò)展對(duì)卵母細(xì)胞核成熟沒(méi)有明顯影響。孫興參等實(shí)驗(yàn)中卵丘擴(kuò)展良好或不好對(duì)卵母細(xì)胞核成熟沒(méi)有明顯的影響，得出豬卵丘細(xì)胞擴(kuò)展不依賴于卵母細(xì)胞 ［ 4］ 。m）； ,級(jí)成熟卵為“卵丘細(xì)胞中等擴(kuò)展”，卵丘細(xì)胞向外擴(kuò)展約 ,倍于裸卵直徑（ 200181。 卵丘擴(kuò)展對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響 在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，卵丘細(xì)胞也隨之成 熟而充分?jǐn)U展，從而中斷了卵丘細(xì)胞之間以及卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的緊密連接狀態(tài)，進(jìn)而疏通了這些細(xì)胞之間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換的通道。這可能是由于牛卵母細(xì)胞在體外大部分可自發(fā)恢復(fù)減數(shù)分裂并發(fā)育至成熟。體外成熟過(guò)程中卵丘細(xì)胞的構(gòu)成蛋白和新生蛋白都有明顯改變，如果在培養(yǎng)過(guò)程中去除卵丘細(xì)胞將明顯降 低牛卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎發(fā)育能力 ［ 3］ 。卵母細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)依賴卵丘細(xì)胞提供，兩者間通過(guò)縫隙連接進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟。到有腔卵泡時(shí)，卵泡細(xì)胞分為兩部分：一部分為壁層顆粒細(xì)胞，與基膜相連：另一部分為包圍卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞。原始卵泡由位于中心的卵母細(xì)胞和其周圍的一層扁平卵泡細(xì)胞組成。在排卵前，由于促性腺激素的作用， 卵母細(xì)胞完成減數(shù)分裂的同時(shí)，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物（ 4C4D）的卵丘發(fā)生擴(kuò)展， 4C4D在體外成熟培養(yǎng)過(guò)程中也發(fā)生類似的變化。 Abeydeera 的研究表明， EGF 能提高卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)的合成，從而提高卵母細(xì)胞胞質(zhì)的質(zhì)量， IGF 對(duì)細(xì)胞具有促分裂、分化及促代謝等生物學(xué)功能，是一個(gè)具有多種生理功能的生長(zhǎng)因子，因此，同樣能促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的成熟，并能提高所得胚胎的發(fā)育能力。Yashida 等報(bào)道在成熟培養(yǎng)基中添加豬卵泡液可顯著提高豬卵母細(xì)胞的核成熟率、正常受精率及卵裂率。此外血清的來(lái)源不同、批次不同均會(huì)導(dǎo)致血清中所含組分及組分間比例不同，從而導(dǎo)致了卵母細(xì)胞體外成熟、體外受精和體外培養(yǎng)的不穩(wěn)定。在豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)中，用得最廣泛的是在成燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書 6 熟培養(yǎng)液中添加 10%的胎牛血清（ Fetal bovine serum， FBS）。但彭禮繁等卻認(rèn)為 LH 對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的促進(jìn)效果要強(qiáng)于 FSH。但葉華虎等研究發(fā)現(xiàn)，受精后胚胎發(fā)育能力 NCSU23占明顯優(yōu)勢(shì)。成熟燕 山 大 學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書 5 培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液不同卵母細(xì)胞成熟后 GSH 的含量存在顯著差異， IVF后雄原核形成率也不同。 成熟基礎(chǔ)液的構(gòu)成 ,直接影響到卵母細(xì)胞的成熟率及以后的受精和胚胎發(fā)育。 Sosnowki 等研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng) 40~48 h 與 30~36 h 對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟率差異顯著，但是分析染色體核型發(fā)現(xiàn)，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，染色體異常率會(huì)隨之增加。在這兩種氣相中， CO2 的含量很關(guān)鍵。 濕度 在 IVM 時(shí)一般采用的是飽和濕度，目的是減少培養(yǎng)基內(nèi)的水分蒸發(fā)，從而維持培養(yǎng)基中卵母細(xì)胞所需要的各種物質(zhì)的濃度及保持滲透壓。 C 級(jí)：裸卵或卵丘細(xì)胞雖為 1~2 層或多層，但是不完整，部分裸露。排卵之前，卵丘細(xì)胞擴(kuò)展，合成大量胞外基質(zhì)，并富含透明質(zhì)酸（ Hyaluronic： HA），有利于排卵后進(jìn)入輸卵管，同時(shí)保證了卵母細(xì)胞正常的受精和胚胎發(fā)育潛力，所以，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)張對(duì)卵母細(xì)胞成熟，特別是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟起著重要作用。 Yoon等研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自3~8mm直徑卵泡 的卵母細(xì)胞成熟率顯著高于小于 3mm的卵泡卵母細(xì)胞 (91%vs 58%)。 一般而言，卵巢離體的時(shí)間要求在 2~4h 內(nèi)，時(shí)間越短，所獲得的卵母細(xì)胞的質(zhì)量 越好，體外成熟培養(yǎng)的效果也越好。無(wú)黃體期卵巢上的卵母細(xì)胞比黃體期卵巢上卵母細(xì)胞成熟效果要好。 不同的國(guó)家和地區(qū)之間，豬的品種必定存在著遺傳因素、飼養(yǎng)環(huán)境和氣候條件等等的因素而帶來(lái)品質(zhì)上的差異，從而影響豬卵母細(xì)胞的質(zhì)量進(jìn)而對(duì)體外成熟培養(yǎng)也產(chǎn)生一定的影響。透明帶是一層糖蛋白膜，受精時(shí)可以結(jié)合并誘導(dǎo)精子發(fā)生頂體反應(yīng)，并阻止多精受精。隨著卵母細(xì)胞的成熟，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，而滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，到成熟晚期，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變得很少。 細(xì)胞核成熟即卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，發(fā)生生發(fā)泡破裂 (genninal vesiclebreakdown， GVBD)并發(fā)育到第一次減數(shù)分裂中期；與此同時(shí)，卵母細(xì)胞進(jìn)一步跨越第一次減數(shù)分裂中期，排出第一極體 (第一極體含有極微量的細(xì)胞質(zhì)，不久就退化 )并停止于第二次減數(shù)分裂的中期，直到受精 (或激活 )后才完成第二次減數(shù)分裂并排出第二極體。核成熟是核膜破裂，同源染色體分離和排出第一極體；胞漿成熟是胞漿內(nèi)各種蛋白組成達(dá)到一定水平及線粒體的有效重排。 ........................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 丘細(xì)胞存在對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響 ........................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 ...........................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 實(shí)驗(yàn)用的儀器 .................................................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 ..................................................................2 ...............................錯(cuò)誤 !未定義書簽。 體外成熟研究進(jìn)展 ....................................錯(cuò)誤 !未定義書簽。第一部分設(shè) 計(jì)擬定探索出卵丘細(xì)胞的存在能夠提高卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)成熟；第二部分設(shè)計(jì)是在第一部分的基礎(chǔ)上分析卵丘細(xì)胞層數(shù)對(duì)母細(xì)胞成熟的影響。 燕山大學(xué) 課 程 設(shè) 計(jì) 說(shuō) 明 書 卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟影響的設(shè)計(jì) 學(xué)院（系）： 年級(jí) 專業(yè)： 0 學(xué) 號(hào)： 學(xué)生 姓名： 指導(dǎo) 教師： 教師 職稱： 燕山大學(xué)課程設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書 院（系）： 基層教學(xué)單位： 學(xué) 號(hào) 學(xué)生姓名 專業(yè)（班級(jí)） 設(shè)計(jì)題目 卵丘細(xì)胞對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響 設(shè) 計(jì) 主 要 內(nèi) 容 對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟的影響 設(shè) 計(jì) 要 求 ， ,設(shè)計(jì)合理的操作方式 總結(jié)與分析 工 作 量 15篇以上的相關(guān)科技文獻(xiàn) 15000字以上 工 作 計(jì) 劃 查閱資料 整理文獻(xiàn) 設(shè)計(jì)方案 撰寫說(shuō)明書 檢查內(nèi)容準(zhǔn)備答辯 參 考 資 料 [1] 陳大元 . 受精生物學(xué) [M]. 北京 科學(xué)出版社 , 2020, 51: 147148. [2] 王海 , 曾申明 , 朱士恩 . 培養(yǎng)介質(zhì)、卵丘細(xì)胞和卵泡直徑對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響 [J]. 中國(guó)畜牧雜志 , 2020, 38: 1516. [3] 錢云 , 丁家桐 , 劉紅林 . 卵母細(xì)胞成熟的形態(tài)學(xué)特征及 其調(diào)控 [J]. 國(guó)外畜牧科技 , 2020, 26: 2630. 指導(dǎo)教師簽字 基層教學(xué)單位主任簽字 說(shuō)明：學(xué)生、指導(dǎo)教師、