【文章內(nèi)容簡介】 白（helper proteins） 腸毒素（enterotoxin） 芽孢,第三十三頁，共九十頁。,殺蟲晶體蛋白（ICP）,基因的定位： ICP基因 cry基因 基因的克隆(k232。 l243。nɡ) 基因的分類 基因的結(jié)構(gòu) 殺蟲機制 應(yīng)用,第三十四頁，共九十頁。,殺蟲晶體蛋白基因(jīyīn)的定位,1953年發(fā)現(xiàn)殺蟲活性與伴孢晶體有關(guān)(yǒuguān) 伴孢晶體由蛋白質(zhì)組成： 殺蟲晶體蛋白，晶體蛋白，毒蛋白，δ內(nèi)毒素 基因定位：大質(zhì)粒、染色體 質(zhì)粒消除、接合轉(zhuǎn)移、分子雜交 Bt質(zhì)粒：多樣性、1～12個、2～200kb,第三十五頁，共九十頁。,殺蟲晶體蛋白基因(jīyīn)的克隆,1981年美國的Schnepf和Whiteley年克隆了第一個殺蟲晶體蛋白基因后，1989年命名為cryIAa（cry1Aa1），對鱗翅目昆蟲(kūnch243。ng)有活性。 1984年Ward等克隆了對雙翅目昆蟲有毒的cyt1A基因。 1987年克隆對鞘翅目昆蟲有活性的cryIIIA（cry3A）。 近年，發(fā)現(xiàn)一些具有特殊活性（對同翅目、膜翅目以及線形動物門和原生動物等具有活性）的cry基因。,第三十六頁，共九十頁。,克隆的Bt殺蟲基因的數(shù)量(sh249。li224。ng)： 1981 第一個cry基因 1990年 46 1995年 107 2000年 198 2007年 374 我國（2000年至今） 61個 , 28%,第三十七頁，共九十頁。,蘇云金桿菌毒蛋白(d224。nb225。i)基因的分類,1989年Hǒfte and Whiteley建立cry基因的分類系統(tǒng)(x236。tǒng)，以cry基因產(chǎn)物的殺蟲譜和基因序列相似性為依據(jù)，將發(fā)現(xiàn)的42種基因分為5類，13個小組： cryI 鱗翅目 130kDa cryII 鱗翅目和雙翅目 70kDa cryIII 鞘翅目 70kDa cryIV 雙翅目 70、130kDa cyt(cytolytic crystal protein coden gene)， 27kDa,第三十八頁，共九十頁。,1995年，Crickmore 28屆無脊椎動物病理學(xué)年會 分類(fēn l232。i)命名原則： 氨基酸同源性 第一等級 小于45% 第二等級 45%78% 第三等級 78%95% 第四等級 95%以上,第三十九頁，共九十頁。,殺蟲晶體蛋白的結(jié)構(gòu)(ji233。g242。u),Cry1Aa,Cry3Aa,Domain I 7個α 螺旋穿孔，毒性(d x236。nɡ)區(qū) Domain II 3個β 折疊，受體特異結(jié)合區(qū) Domain III 2個β 折疊，毒性保護區(qū),第四十頁，共九十頁。,Bt殺蟲晶體蛋白的保守(bǎoshǒu)區(qū)域,第四十一頁，共九十頁。,殺蟲晶體蛋白的殺蟲機制(jīzh236。),伴孢晶體的溶解： 昆蟲腸道環(huán)境(hu225。nj236。ng) pH 原毒素的激活： 蛋白酶消化 60kDa核心片段 與受體結(jié)合 BBMV（刷狀緣膜囊） 穿孔和離子通道 發(fā)夾結(jié)構(gòu)，“刀狀”模型 腸細(xì)胞破壞而死亡 離子梯度，細(xì)胞裂解,第四十二頁，共九十頁。,第四十三頁，共九十頁。,第四十四頁，共九十頁。,第四十五頁，共九十頁。,世界上第一批蘇云金桿菌(Bt)制劑的工業(yè)產(chǎn)品于1958年誕生于美國。 目前已有60多個國家生產(chǎn)120多種商品，并成為世界上產(chǎn)量最大、防效最好、應(yīng)用最廣的微生物殺蟲劑，廣泛用于防治農(nóng)業(yè)害蟲、林業(yè)害蟲、醫(yī)學(xué)昆蟲和倉貯害蟲。 在微生物農(nóng)藥行業(yè)(h225。ngy232。)中蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑成為支柱產(chǎn)業(yè)之一。 優(yōu)點：選擇性強，對人畜、天敵、植物都十分安全，堪稱“無公害”農(nóng)藥。,Bt的應(yīng)用(y236。ngy242。ng),第四十六頁，共九十頁。,第四十七頁，共九十頁。,第四十八頁，共九十頁。,第四十九頁，共九十頁。,第一代Bt殺蟲劑的缺點： 殺蟲蛋白類型比較單一、殺蟲譜較窄：雖然發(fā)現(xiàn)Bt可以(kěyǐ)殺死節(jié)肢動物門昆蟲綱中的鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等，還可以(kěyǐ)殺死線形動物門、扁形動物門、原生動物門等，但就某一個菌株或亞種來說，它的殺蟲譜還是比較窄，使用對象主要限于鱗翅目害蟲。 毒蛋白晶體易分解：受自然環(huán)境影響，特別經(jīng)紫外線照射極易分解破壞，田間殺蟲效果通常僅能維持3～4天。,第五十頁，共九十頁。,Bt的基因工程(jīyīn gōngch233。ng),Bt基因工程(jīyīn gōngch233。ng)微生物的構(gòu)建 抗蟲轉(zhuǎn)Bt基因植物,第五十一頁，共九十頁。,Bt 工程(gōngch233。ng)微生物,廣譜Bt工程菌的構(gòu)建(ɡ242。u ji224。n) 高效表達Bt工程菌的構(gòu)建 延長持效期工程菌的構(gòu)建 延緩抗性Bt工程菌的構(gòu)建 多功能Bt工程菌的構(gòu)建,第五十二頁，共九十頁。,(1) 質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移 為了增強Bt的殺蟲范圍，可消除毒蛋白表達水平較低的質(zhì)粒而保留表達水平較高的質(zhì)粒，或?qū)⒉煌瑏喎N、不同菌株中的質(zhì)粒通過接合作用加以復(fù)合。 美國Ecogen公司1991年注冊的生物殺蟲制品Foilo F的有效成分EG2424。 EG2424在孢子形成期產(chǎn)生cryⅢA和cryⅠA(c)蛋白，形成菱形和雙金字塔形晶體(jīngtǐ)，對玉米螟與馬鈴薯甲蟲害蟲均有殺傷作用，已應(yīng)用到土豆、茄子及其它農(nóng)作物的生物防治中 。,廣譜(ɡuǎnɡ pǔ)Bt工程菌的構(gòu)建,第五十三頁，共九十頁。,cryIIIA,cryIA(c),cryIIIA,cryIIIA,cryIA(c),EG2424 (Foilo F),Bt. kurstaki HD2638,Bt. morrison EG2158,第五十四頁，共九十頁。,（2） 殺蟲蛋白基因的體外重組 重組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展，為構(gòu)建新Bt工程菌提供了更大的靈活性。 許多殺蟲蛋白基因不能通過接合作用進入一個新的受體細(xì)胞，因為并不是每一種(yī zhǒnɡ)質(zhì)粒都可以通過接合進行轉(zhuǎn)移。另外，對于幾種昆蟲特異的ICPs可能定位在同一質(zhì)粒上。,第五十五頁，共九十頁。,Crickmore等（1990〕將對鞘翅目昆蟲有效(yǒuxi224。o)的擬步行甲亞種tenibrionis亞種的毒蛋白基因cryIIIA導(dǎo)入對雙翅目有效的isreal亞種，新菌株不僅對鞘翅目以及雙翅目蚊幼蟲有毒外，還產(chǎn)生了一種新的殺蟲活性，對鱗翅目的菜青蟲也具有一定的殺蟲活性。 Gamel and Piot把鞘翅目特異的cryIII基因利用載體導(dǎo)入Bt subsp. kurstaki，轉(zhuǎn)基因菌株不僅表達了高水平的鞘翅目殺蟲活性，而且保持了對鱗翅目昆蟲的殺傷作用。,第五十六頁，共九十頁。,第五十七頁，共九十頁。,第五十八頁，共九十頁。,第五十九頁，共九十頁。,高效(ɡāo xi224。o)表達Bt工程菌的構(gòu)建,（1）在無芽孢 (Spo) 或經(jīng)消除 (或部分消除) 質(zhì)粒的受體菌中表達ICP基因 crycry2和cry11類基因是依賴于芽孢形成的ICP基因，它們的表達受到芽孢形成過程(gu242。ch233。ng)的調(diào)控。 cry3A是一類不依賴于芽孢形成過程的ICP基因。Cry3A蛋白在無芽孢的菌株中的產(chǎn)生量是野生菌株的2.5倍。 通過質(zhì)粒消除使菌株的毒力得以提高。,第六十頁，共