【文章內(nèi)容簡介】 溫烘干，用粉碎機粉碎，用40目篩篩取， 留著備用。 無水乙醇，鄰苯三酚，雙氧水，鄰菲羅啉，磷酸鹽 生理鹽水緩沖溶液（用分析天平稱 ， ， 酸氫二鉀，溶于 800mL蒸餾水中，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液 pH為 ，然后加蒸餾水定容到 1L），硫酸亞鐵，葡萄糖為國產(chǎn)分析純，蒸餾水，維生素 C 溶液，蒽酮 硫酸溶液（稱量 ，加入 100mL、質(zhì)量分數(shù) 98%的濃硫酸溶液，搖勻，放在棕色試劑瓶中，低溫保存），無水丙酮， TrisHCl（ pH=， ）緩沖溶液 （稱取 25gTris試劑溶于蒸餾水中，加 8mL濃鹽酸溶液，然后定容至 1L，高 壓、 高 溫 滅菌后室溫下保存）。 實驗器材 RE52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、 AL104電子分析天平 (瑞士梅特勒托利多儀器有限公司）、 UV1100紫外 可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司）、離心機、 SHA水浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市醫(yī)療器械有限公司）、 PHS3C型 pH計（上海天達儀器有限公司）、 真空抽濾機、 DF101干燥箱、錐形瓶、吸量管 (1mL、 2mL、 5mL）、洗耳球、比色管、容 量瓶。 實驗方法 粗多糖提取的方法 多糖的提取一般有超微波輔助法、微波輔助法、酶法、熱水浸提法。本文所用的是熱水浸提法。它的原理是在熱力作用下，細胞的質(zhì)壁分離。水溶劑滲入到細胞質(zhì)、細胞壁中，溶解了液泡里的物質(zhì)，并且通過細胞壁擴散到外部。 取一定量預處理過的樣品，按 1:10的料液比加入 95%（ V/V）的乙醇，低溫浸泡 12h。過濾，濾渣按一定的料液比加入蒸餾水，熱水浴中保溫一定時間。減壓 抽濾得到濾液，濾渣二次浸提，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原來體積的 1/4，加入 3倍于濃縮液的 95%（ V/V)乙醇， 3℃ 下放置過夜，密封 好 ，當有粒狀沉淀和絮狀膠狀物產(chǎn)生后，用離心機以 30分鐘、 3000r/min去上清液，沉淀復溶再離心、抽濾后，用無水丙酮、乙醇 多次 洗滌，干燥得到樣品的粗多糖提取物，備用。 多糖提取率 =多糖質(zhì)量 /樣品質(zhì)量 100% 標準曲線的繪制 [6] 先打開紫外分光光度計進行預熱。 清洗七個比色管，干燥編號備用。然后用分析天平稱取 5 糖，蒸餾水溶解后，完全轉(zhuǎn)移到 100mL容量瓶進行定容，得 糖標準溶液。然后用 1mL的吸量管分別移取 、 、 、 、 、 的葡萄糖標準溶液于干燥的比色管中，再用 2mL的吸量管分別移取 、 、 、 、 ，補至 。將七個比色管放在冰水浴中，用 5mL的吸量管迅速移取 硫酸溶液分別加入比色管內(nèi)，搖勻。然后將 7個比色管放在沸水浴中加熱 10分鐘后，取出來，放在盛有自來水的大燒杯中冷卻至室溫。用紫外分光光度計從低濃度到高濃度在 625nm波長下，分別測定它們的吸光度。記下數(shù)據(jù)，以吸光度為縱坐標、葡萄糖濃度為橫坐標，用 excel繪制葡萄糖溶液的標準曲線，得到相關系數(shù)和回歸方程。 多糖含量 的 測定方法 用電子天平稱取樣品粗多糖提取物 ，三份，蒸餾水溶解后，完全轉(zhuǎn)移到 100mL容量瓶中 并 且搖勻定容。移取 25mL的比色管中，再移取 ,將比色管放入冰水浴中，迅速加 蒽酮 硫酸溶液，搖勻。然后放在沸水浴中加熱 10分鐘，取出，放在乘有自來水的大燒杯中冷 卻至室溫。以 蒸餾水 為參比，迅速用紫外分光光度計在 625nm的波長下，測得它的吸光度，然后代入回歸方程求出多糖的濃度，并且算出多糖在樣品粗提取物中的含量。 多糖對 羥基自由基 (OH）消除作用的測定方法 [7] 本文采用的是用 Fenton法反應形成羥基自由基的體系。 Fe2+ 與 H2O2 在Fenton反應中產(chǎn)生羥基自由基的方程式如下： ?? 222 FeOH === ?? ??? 3FeOHOH 向該反應體系中加入鄰菲羅啉，由于羥基自由基活性很高 ， 能夠很有效的被鄰菲羅啉所結(jié)合，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)在 510nm處有最大吸收。當加入多糖溶液后，多糖溶液就會與羥基自由基結(jié)合，減少了鄰菲羅啉與羥基自由基結(jié)合而生成的有色物質(zhì)，減弱了在 510nm處的吸光值。通過測定添加了多糖溶液的體系的吸光度來判斷它的消除能力。方法如下： 首先用分析天平精確稱量提取的樣品粗多糖沉淀 ，用蒸餾水溶解后，在 100mL的容量瓶中定容，配成濃度為 ，取母液進行稀釋 至濃度為 、 、 、 、 。配制維生素 C溶液用同樣的方法。 取 6支干燥且干凈的比色管，依次編號、分別向里面加入 溶液，磷酸鹽 生理鹽水（ pH=）緩沖溶液 ， 和 、 、 、 、 （注： 1號為空白對照，用蒸餾水代替多糖溶液）。再加 ，迅速搖勻，再加 %的過氧化氫溶液 ， 將五支比色管放在 38℃ 的 熱水浴中反應 1小時，然后迅速測定 6 各管在 510nm下的吸光度。再將維生素 C藥片研磨，稱取，配制同濃度的維生素C溶液作對比。清除率的計算： OH清除率 =(A0A樣品 )/A0 100% 多糖對超氧自由基（ O 2）消除作用的測定方法 [8] 對超氧陰離子清除采用的是鄰苯三酚自氧化法。鄰苯三酚可以在堿性條件下發(fā)生自身氧化生成超氧自由基（ O 2）、以及紅色中間物質(zhì)。超氧自由基能夠加速鄰苯三酚的氧化速率，如果有清除劑的加入，會消除 O 2 ，減少了紅色中間產(chǎn)物的積累，降低了在 310nm處的吸光度。通過測定加入多糖溶液的體系的吸光度來判斷它的消除能力。方法如下： 取 6支干燥且干凈的比色管，依次編號、分別向里面加入 、TrisHCl（ pH=， ）緩沖溶液 ， 放在 25℃ 的熱水浴中 25分鐘，然后向比色管中依次加入 、 、 、 、 、 （注： 1號管為空白對照，用蒸餾水代替多糖溶液）。迅速加入在 25℃ 熱水浴中預熱 20分鐘的鄰苯三酚（ ） ，搖勻。放置在 20℃ 水浴槽中反應 5分鐘，最后加入 HCL（ 8mL/L）溶液結(jié)束反應。將各管在 310nm處測定它的吸光度，再將維生素 C藥片研磨，稱取，配制同濃度的維生素 C溶液作對比。清除率計算： O 2 清除率 =(A0A樣品 )/A0 100% 2 結(jié)果與分析 干木耳粗多糖提取的條件優(yōu)化及含量的測定 多糖在熱水提取的過程中，有許多因素會影響多糖提取率。本文針對浸提料液比、溫度、時間這三個條件進行探究 [9]。 浸提時 間對多糖提取的影響 固定溫度為 85℃ 、料液比 1:30不變。時間為 、 、 、 ，根據(jù) ，結(jié)果如下： 表 21 浸提時間對多糖提取率的影響 時間 /h 1 2 3 4 提取率 /% 由結(jié)果得出，隨著時間的增 大 ，提取率先增 大 后減小。當浸提時間為 ，提取率最大，繼續(xù)增加時間，提取率開始下降。 浸提溫度對多糖提取的影響 固定浸提時間為 ，料液比 1:30不變。溫度為 50、 60、 70、 7 80、 890、 95℃ 。根據(jù) ，結(jié)果如下： 7 表 22 浸提溫度對多糖提取率的影響 溫度 /℃ 50 60 70 75 80 85 90 95 提取率 /% 由上表中數(shù)據(jù)表明，隨著溫度的升高，多糖的提取率也會隨之增加。但是過高溫度會分解多糖，多糖的活性受到影 響，所以我們選擇 90℃ 作為我們的浸提溫度。 浸提 料液比對多糖提取率的影響 由表 2表 22可知，固定浸提時間為 ，浸提溫度為 90℃ 不變。料液比分別 1: 1: 1: 1:50、 1:60、 1:70。根據(jù) ，結(jié)果如下：