【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 液→H2O2脫色(，40℃水浴保溫4h脫色。) →606512旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→加入4倍體積的無水乙醇4℃沉淀過夜→離心(8000rpm，10min) →沉淀物用80%乙醇、丙醇、石油醚依次洗滌→室溫真空干燥得多糖粗品。 準(zhǔn)確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品21mg，蒸餾水溶解后，定容至100 ml，／ml的葡萄糖母液。準(zhǔn)確吸取此溶液5ml，分別置于10ml具塞試管中，并用蒸餾水定容，準(zhǔn)確吸取各濃度溶液2m1分別置于10ml具塞試管中，每管加入5％(取苯酚100g，,，蒸餾收集182℃餾分。，加水150ml溶解，置棕色瓶?jī)?nèi)放冰箱內(nèi)備用)。，井用蒸餾水定容至刻度，搖勻，放置5min，用分光光度計(jì)于490nm處測(cè)定吸光值，同時(shí)以試劑空白作參比。以最小二乘法作線形回歸方程，得葡萄糖質(zhì)量濃度c(mg／ml)與吸光度月的關(guān)系為：A=+，R2=。／ml范圍內(nèi)，吸光度與濃度線形關(guān)系良好。 ，定容，作供試液；，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制各項(xiàng)下自加入“”起，于490nm處測(cè)定吸收度。從回歸方程求出供試液中葡萄糖含量，按下式計(jì)算多糖含量：多糖含量W%=，其中c為供試液的葡萄糖濃度(mg／m1)，D為供試液的稀釋因素，f為換算因素，m為供試品重量(mg)。 ，用蒸餾水定容。取按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，根據(jù)回歸方程計(jì)算多糖中葡萄糖的濃度，按下式計(jì)算出換算因子f，f=W／C*D，其中w為多糖質(zhì)量(mg)，C為葡萄糖濃度(mg／m1)，D為稀釋因素。 取供試液，每隔一定時(shí)間測(cè)定吸光度值，觀察其結(jié)果在顯色一定時(shí)間內(nèi)吸光度值有無變化。2 3 蒸餾水為提取溶劑，分別研究不同溶劑用量(10倍、15倍、20倍、25倍、30倍)：不周提取溫度(60℃、70℃、80℃、90℃、100℃)；不同提取時(shí)間(60min、90min、120min、150min、180min)；不同提取次數(shù)(1次、2次、3次、4次、5次)等單因素對(duì)辣木中多糖量的影響。 考慮到上述各因素之間的互作效應(yīng)，(34)進(jìn)行正交試驗(yàn)。表2多糖正交實(shí)驗(yàn)因素水平表水平ABCD提取溫度/℃溶劑用量/倍提取時(shí)間/min提取次數(shù)1801590129020120231002515033結(jié)果與分析表3多糖正交實(shí)驗(yàn)因素水平表提取方法黃酮總量/%顯著性123平均值標(biāo)準(zhǔn)差回流法aA水提法aA超聲法bB離心法cC分級(jí)法cC采用水提取、有機(jī)溶劑回流提取、有機(jī)溶劑離心提取、超聲波提取和分級(jí)沉淀提取等五種方法對(duì)辣木葉粉中總黃酮進(jìn)行了提取，提取效果如表3所示。五種方法都能從辣木中提出黃酮。但在不同的提取方法下辣木葉總黃酮量不同，％～％之間，總黃酮量較高的是回流法和水提法，超聲法次之，總黃酮量量較低的是離心法和分級(jí)沉淀法。其中回流法和水提法差異不顯著。 本研究以最小二乘法作線形回歸方程，得蘆丁質(zhì)量濃度C(mg／m1)與吸光度A的關(guān)系為：A=，相關(guān)系數(shù)r= mg／ml范圍內(nèi)。吸光度與濃度線形關(guān)系良好.，分置于10ml容量瓶中，各加乙醇至5ml；，測(cè)定結(jié)果見圖l。試驗(yàn)表明，在室溫≤25℃的環(huán)境中，顯色時(shí)問在15～70min范圍內(nèi)，吸光度沒有變化。80min以后開始下降。因此，在本試驗(yàn)選擇的測(cè)定時(shí)間內(nèi)，黃酮類化合物與鋁離子生成的絡(luò)合物顯色是穩(wěn)定的。圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性表4 不同溶劑回流的辣木葉總黃酮量溶劑黃酮總量/%顯著性123平均值標(biāo)準(zhǔn)差乙醇aA甲醇aA丙酮bB?；亓鞣ㄌ崛〉睦蹦救~總黃酮量最高，在此基礎(chǔ)上其他條件一致，選用三種不同的溶劑對(duì)辣木葉干粉中黃酮進(jìn)行了回流提取，結(jié)果如表4。從表中可以看出?；亓鞣ǖ奶崛∪軇┮砸掖甲詈?，甲醇次之，丙酮最差。但從經(jīng)濟(jì)、安全方面考慮，用乙醇作溶劑更為實(shí)用。 綜合以上結(jié)果可知。用水提法、甲醇回流法和乙醇回流法均對(duì)辣木總黃酮具有較高的提取率。從經(jīng)濟(jì)、安全、實(shí)用方面考慮，乙醇回流法是最適合辣木總黃酮的提取方法。其他條件相同的時(shí)候，分別以不同濃度的乙醇溶液回流提取黃酮。從圖2可以看出：乙醇濃度在60%～80%的范圍內(nèi)辣木葉總黃酮量較高，其中以70％的乙醇提取效果最好，％；乙醇濃度高于80％提取效果顯著降低，％％。這是由于乙醇濃度過高，使黃酮類化合物的溶解度下降，而脂溶性物質(zhì)的溶出量增加，從而導(dǎo)致黃酮類化舍物的浸出率下降。圖2 不同乙醇濃度下提取的辣木葉總黃酮量條件：5g，70℃，乙醇用量20倍，回流3次，每次120min 如圖3所示，隨乙醇用量的增加，辣木葉總黃酮量呈梯度變化。其中乙醇用量由10倍上升到20倍時(shí)，黃酮類物質(zhì)浸出率上升比較快，％％.總黃酮量達(dá)到最大；乙醇用量在20倍以后。辣木葉總黃酮有所下降，但在乙醇用量為25倍時(shí)。總黃酮量變化不明顯。乙醇用量越大，濃度梯度越大，物質(zhì)溶出越多，所以20倍的乙醇用量是一個(gè)平衡點(diǎn)。圖4不同條件下提取的辣木葉總黃酮量條件：5g，70%乙醇20倍，回流3次，每次120min其它條件一定時(shí)，考察提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響。從圖5可以看出：，提取時(shí)間達(dá)到120min時(shí)，總黃酮量達(dá)到最大，當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)加長(zhǎng)時(shí)，對(duì)總黃酮量的影響不大，表明提取時(shí)間達(dá)到120min時(shí)，有效成分已基本溶出。圖5 不同提取時(shí)間下提取的辣木葉總黃酮量條件：5g，70℃，70%乙醇20倍，回流3次如圖6所示，辣木葉總黃酮量呈上升的趨勢(shì)。當(dāng)提取次數(shù)到4次時(shí)，總黃酮量變化不大，說明提取4次以后，有效成分已基本溶出。圖6不同提取次數(shù)下提取的辣木總黃酮量條件：5g，70℃,70%乙醇20倍，每次120min 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析(表5)和方差分析(表6)，可以看出，辣木乙醇回流提取時(shí)。各個(gè)因素對(duì)辣木葉總黃酮提取效果影響程度不同，各因素的影響程度依次為提取次數(shù)(D)提取溫度(A)乙醇用量(B)提取時(shí)間(C)。由方差分析結(jié)果可知，但均未達(dá)到顯著水平。各因素的最佳組合水平為A3B2C1D3，即辣木總黃酮的最佳提取條件為：用70%的乙醇作為提取溶荊，提取溫度80℃，乙醇用量20倍，提取時(shí)間90min，提取次數(shù)3次。在此提取條件下。％。陳瑞嬌對(duì)辣木葉總黃酮提取效果的研究結(jié)果認(rèn)為，提取條件的影響程度為提取次數(shù)提取溫度乙醇用量提取時(shí)間，與本文研究結(jié)果完全一致。但最佳提取條件為：用70%的乙醇作為提取溶劑。提取時(shí)間60min，提取次數(shù)3次，在此提取條件下，％。其測(cè)定結(jié)果與本研究有較大差異。原因可能與測(cè)定方法、辣木產(chǎn)地、辣木采集時(shí)間、采集部位等因素有關(guān)。表5 辣木葉總黃酮提取條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)號(hào)總黃酮量/%ABCD111112122231333421235223162312731328321393321K1K2K3X1X2X3R表6 不同提取條件下辣木葉總黃酮量的方差分析誤差來源離差平方和自由度方差方差比F臨界值SsfsFA2=B2=C2=D2誤差8 表7的結(jié)果表明：隨著葉齡的增長(zhǎng)，辣木葉片的總黃酮含量呈不規(guī)律變化，當(dāng)葉齡增長(zhǎng)到45d時(shí)，葉片的總黃酮含量達(dá)最高，％；其次為生長(zhǎng)15d的幼齡葉和60d的老齡葉，％~％之間；生長(zhǎng)30d的壯齡葉的總黃酮含量最低，％。45d葉的總黃酮含量與15d葉差異不顯著。顯著大于30d和60d葉齡葉的總黃酮含量。表7 不同葉齡葉片辣木的總黃酮量含量變化（n=9）葉齡/d總黃酮含量/%15177。abAB30177。bB45177。aA60177。bB注：表中相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著（P,P,多重比較采用Duncan）以上結(jié)果表明，辣木葉片中的黃酮在幼嫩的葉中就有較高的含量，隨著葉片的快速擴(kuò)展，在葉片的壯齡期略有降低，可能是由于葉片的生長(zhǎng)速度快于黃酮的合成速度；當(dāng)葉面積的擴(kuò)展變緩時(shí)，黃酮的積累量達(dá)到了最高值；隨著葉片的老化，黃酮含量出現(xiàn)了下降趨勢(shì)。因此。以提取黃酮食用新鮮蔬菜等為目的辣木葉片的采收應(yīng)以葉齡45d左右的葉為最佳。由表8可以看出：，器官間總黃酮含量依次為：花柄葉花葉柄莖果果莢種子根，其中花柄中的總黃酮含量最高，％；其次為葉片，％；根中的黃酮含量最少，％。差異顯著性分析表明，除果與果莢、種子與根之間差異不顯著外，其他器官問差異均達(dá)到了極顯著水平。表8不同器官辣木總黃酮含量的變化（n=3）器官總黃酮含量/%葉177。bB葉柄177。dD莖177。eE花177。cC花柄177。aA果177。fF果莢177。fF根177。gG種子177。gG注：表中相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著（P,P,多重比較采用Duncan） 從7到11月，每月采收一次辣木的葉、葉柄和莖，比較同一器官、不同采收期的辣木總黃酮含量。從表10中可以看出，不同器官辣木的總黃酮含量隨采收時(shí)期的變化規(guī)律是一致的。各器官的總黃酮含量都以在兒月采收時(shí)為最高，％、%、％；以9月采收時(shí)為最低。其中11月采收的辣木葉總黃酮含量與其他4個(gè)月采收的差異極顯著：10月采收的辣木葉總黃酮含量間差異不顯著；它們都顯著高于9月采收的辣木葉總黃酮含量。11月采收的辣木葉柄總黃酮含量顯著大于其他幾個(gè)月，除了8月與9月之間差異顯著外，其他各月之問差異均不顯著。11月采收的辣木莖總黃酮含量與8月采收的辣木葉柄總黃酮含量差異不顯著，但顯著大于10月采收的辣木葉總黃酮含量，極顯著大于9月采收的辣木葉總黃酮含量，因此，該種植地的辣木最佳采收期是11月。表10 不同采收期辣木總黃酮含量的變化（n=12）采收期/月總黃酮含量/%葉葉柄莖7177。177。177。8177。177。177。9177。177。177。10177。177。 BCb177。11177。177。177。注：表中縱向的大寫字母