【文章內(nèi)容簡介】 分。研究表明， BAI對多種革蘭染色陽性菌、革蘭染色陰性菌及螺旋體等均有抑制作用。 黃芩也具有抗真菌活性，對多種致病性真菌，如白色念珠菌，許蘭毛癬菌等有一定抑制作用。近來研究顯示， BAI還具有抗艾滋病病毒 HIV的作用，能誘導感染 HIV的細胞發(fā)生凋亡。 (7) 降血糖血脂作用 動物實驗證明葛根黃酮、飛薊素等具有有降血脂和降低膽固醇的作用。它們可顯著降低四氧嘧啶誘導的糖尿病大鼠的血糖和血清膽固醇水平，降低胰島的 MDA水平，升高 血和胰島的谷光甘肽 (GSH)水平。麥胚黃酮卷柏黃酮可降低糖尿病大鼠血清過氧化脂含量，增強谷光甘肽過氧化酶的活力。其作用機制與清除自由基，抑制脂質(zhì)過氧化反應，對抗四氧嘧啶所致的 β 細胞損傷促進 β 細胞修復和再生密切相關(guān)。此外枸杞黃酮等也有降血脂的作用。 (8) 黃酮類化合物在食品方面的應用 除了作為藥物使用以外，在食品工業(yè)上，也把它作為功能食品的添加劑、天然抗氧化劑、天然色素和天然甜味劑等等。近年來上市的保健產(chǎn)品中，大部分功效成分都屬于黃酮類化合物。從加工過程看主要有兩種形式，一種是用富含黃酮類的原料直接加工成食品，在加工過程中最大程度地保留有效成分；另一種是從原料中提取出黃酮類物質(zhì)，再把他添加到其他原料中進行加工制成產(chǎn)品。 決明子中黃酮類化合物提取方法 黃酮提取的方法很多，主要是根據(jù)黃酮化合物的結(jié)構(gòu)與來源的不同，溶解性差異較大，因此，應根據(jù)其極性和水溶性的大小選擇合適的溶劑進行提取。目前，對苷類和極性較大的苷元，常用某些極性較大的混合溶劑 (如甲醇～水 (1： 1)、水、甲醇、乙醇、丙酮進行提取，而對大多數(shù)苷元則采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等極性小的溶劑進行提取。 12 決明子中黃酮類化合物為極性較大的甘元，所以主要用有機溶劑提取法 、微波提取法等方法。生物酶法提取植物中黃酮的提取效果好、提取率高，已被廣泛應用 15。 (1) 水提法 水提法僅限于黃酮苷類物質(zhì)，在提取的過程中要考慮加水量、浸泡時問、攪拌速度、煎煮時間及煎煮次數(shù)等因素。此工藝成本低、安全、設(shè)備簡單，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，但是用水提取時，提取中雜質(zhì)較多 (如無機鹽、蛋自質(zhì)、糖類等 )，后續(xù)分離麻煩?，F(xiàn)在，很少單一使用本方法。 (2) 堿性水或堿性稀醇提取法 黃酮類物質(zhì)大多具有酚羥基，因此可以用堿水或堿性稀醇浸出，經(jīng)酸化后得出黃酮類物質(zhì)。主要用堿性溶液是吸氫氧化鈉和石灰水 (氫氧化鈣水溶液 )。氫氧化鈉水溶 液的浸出能力高，但雜質(zhì)較多不利于純化。石灰水可以使～些鞣質(zhì)和水溶性雜質(zhì)沉淀生成鈣鹽沉淀，但浸出效果不如氫氧化鈉水溶液效果好，同時有些黃類化合物能與鈣結(jié)合成不溶性物質(zhì)，不被溶出。一般可以根據(jù)不同的原料使用不同堿性溶液。 (3) 有機溶劑提取法 這是國內(nèi)外使用最廣泛的方法。有機溶劑主要用乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇等。此方法主要用于提取脂溶性基團占優(yōu)勢的黃酮類物質(zhì)，對設(shè)備要求簡單，產(chǎn)品得率高，但成本較高，雜質(zhì)含量也較高。常見的可以分為三種方法：冷浸法、滲漉法、回流法。有機溶劑提取中最常使用的溶劑是乙醇，乙醇的濃度對總黃酮的 提取有較大的影響。一般來說，乙醇的濃度增高有利于總黃酮的提取，但也不是絕對的，有時還與黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，高濃度的乙醇適用于提取黃酮苷元類，的濃度乙醇適用于提取黃酮苷類。本方法經(jīng)常與液—— 液萃取法、吸附洗脫法相結(jié)合，能得到更高純度的精制物。 (4) 微波法 微波技術(shù)在中草藥的應用上越來越廣泛，原理是利用磁控管所產(chǎn)生的每秒 24． 5億次超高頻率的快速震動，使藥材內(nèi)分子問相互碰撞、擠壓，有利于藥材有效成分的浸出。此法對黃酮類物質(zhì)的提取也取得了不錯的效果，具有反應高效性和強選擇性等特點，操作簡單、副產(chǎn)物少，產(chǎn)率高及產(chǎn)物易 提純等優(yōu)點。浸出過程中中藥材細粉不凝聚、不襁化，克服了熱水法易凝聚、糊化的不足。 (5) 酶解法 對于一些黃酮類物質(zhì)被細胞壁包圍不易提取的原料使用酶解的法比較實用。原理是沒能夠充分破壞以纖維索為主的細胞壁結(jié)構(gòu)及其細胞間相連的果膠，使植物中的果膠完全能夠分解成小分子物質(zhì)，減小提取的傳質(zhì)阻力，是植物中的黃酮 類物質(zhì)能夠充分地釋放出來。 (6) 超臨界萃取法 13 超臨界 C02萃取技術(shù)是以液態(tài) C02為溶劑進行提取的，是一種不同于傳統(tǒng)黃酮類物質(zhì)提取的新工藝，它的提取率與提取溫度、提取壓力、 C02消耗量等因素有關(guān)。與其它工藝相比較，該技術(shù) 具有提取率高、無殘留溶劑、無污染，活性成分和熱不穩(wěn)定成分不易被分解破壞而保持天然特征，此技術(shù)為中草藥有效成分的熱敏性物質(zhì)的提取研究開辟一條新路。同時，還可以通過控制臨界溫度和壓力達到選擇性提取和分離純化的目的。缺點是超臨界提取所需設(shè)備價格昂貴、生產(chǎn)成本高、提取物中烷基酚含量較高、對極性大的物質(zhì)提取不理想。目前還難以進行規(guī)?；a(chǎn)，但本法在生產(chǎn)銀杏黃酮的技術(shù)上取得了重大突破 . 黃酮類化合物的常用分析側(cè)定方法 (1) 比色法 這是分析提取物總黃酮含量最普遍的方法。通常采用的顯色方法有以下兩種 [16]： 亞硝酸鈉 硝酸鋁顯 色法 以蘆丁為標樣，將一定量提取液置 25mL比色管中，用 30％ (v/v)乙醇補充至 ，加入 ％ NaNO2，搖勻，靜止 5min后加入 ％ Al(NO3)3， 6min后再加入 5mL4％ NaOH，搖勻，用 30％ (v/v)L醇稀釋至刻度， 10rain后于 510nm進行比色。 AlCl3顯色法 以蘆丁為標樣，在測定液中加入 AlCl3搖勻，室溫放置 10min，按分光光度法，在 200500nm范圍內(nèi)迸行掃描，尋找二者重疊最吸收波長，測定。 兩種方法機理不同，亞硝酸鈉 硝酸鋁顯色原理文獻 認為是蘆丁 NaNO2Al(NO3)3NaOH試劑在蘆丁 B環(huán)的 3’,4鄰二酚羥基部位反應產(chǎn)生紅色物質(zhì)。 AlCl3顯色法原理是 Al3+與 3或5fE基與 4羥基，或者 B環(huán)的 3’,4二鄰二酚羥基絡(luò)合顯色。 (2) 紫外法 采用標準品與提取液在紫外區(qū)掃描，確定最大吸收波長，制標準曲線測定總黃酮含量 (3) HPLC 法 在銀杏 、花生殼的 黃酮定量中，由于黃酮苷較多，多采用酸水解成苷元，在 測 定總黃酮的方法中，大多采用榭皮素作對照品，也有用懈皮素、山奈酚和異鼠李素三種作為對照品。 研究的目的與內(nèi)容 本文的研究目的是應用有機溶劑萃取 方法，提取決明子中黃酮類化合物。 重點 研究不同提取條件對 黃酮提取效率的影響，確定其影響程度的大小，尋找最佳提取工藝條件。 本論文的 研究包括以下內(nèi)容： (1) 蘆丁標準曲線的繪制。 (2) 決明子中黃酮總含量的測定。 (3) 不同提取劑對決明子中黃酮浸提效果的影響。 14 (4) 乙醇濃度對決明子 中 黃酮浸提效果的影響 。 (5) 提取 溫度對決明子 中 黃酮浸提效果的影響 。 (6) 提取時間對決明子 中 黃酮浸提效果的影響 。 (7) 料液比對決明子 中 黃酮浸提效果的影響 。 (8) 進行正交實驗確定最佳提取條件。 15 第 2章 實驗部分 黃酮類化合物的溶解度與黃酮苷元的結(jié)構(gòu)及其配基的不同而有很大的差異，一 般游離苷元難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機溶劑中。黃酮類苷元分子中引入的羥基越多，其溶解度越大。黃酮類化合物的羥基糖苷元化后，水溶解度較大，而在一些較低極性的有機溶劑中溶解度較低。黃酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等強極性的溶劑中；難溶于或不溶于苯、氯仿等有機溶劑中。糖鏈越長，則水溶解度越大。 儀器與藥品 實驗儀器 表 21 實驗儀器 名稱 型號 生產(chǎn)廠家 循環(huán)水式多用真空泵 SHB—Ⅲ 鄭州長城科工貿(mào)有限公司 電子恒溫不銹鋼水浴鍋 HHS—2S 上海市南陽儀器有限公司 可見分光光度計 722N 上海精科電子有限公司 調(diào)溫電加熱套 DZHW 河北省黃驊市中興儀器有限公司 電子天平 AW220 慈溪市天東衡器廠 大功率粉碎機 QE—100 武漢縣工具有限公司 索氏提取器 天津北辰區(qū)光明儀器廠 蒸餾裝置 M22 型中量 天津玻璃儀器廠 電熱干燥箱 202—3 北京金北德工貿(mào)有限公司 實驗藥品 選用決明子在北吉大藥房購得，產(chǎn)地為廣西省。 16 表 22 實驗藥品 名稱 分子式 純度 生產(chǎn)廠家 蘆丁標準物質(zhì) C27H30O16 西安旭煌生物技術(shù)有限公司 95%乙醇 CH3CH2OH 天津永晟精細化工有限公司 無水甲醇 CH3OH 天津光復精細化工研究所 丙酮 CH3COCH 天津風船化學試劑科技有限公司 石油醚 天津永晟精細化工有限公司 亞硝酸鈉 NaNO2 天津永晟精細化工有限公司 硝酸鋁 Al2(NO3)39H2O 天津永晟精細化工有限公司 氫氧化鈉 NaOH 天津永晟精細化工有限公司。 實驗 過程 實驗流程及裝置圖 實驗流程如圖 21 所示。 圖 21 黃酮提取實驗流程 實驗所用儀器裝置見 圖 22.、 23 吸光度 A中藥決明子測定吸光度黃酮水溶液 2加入顯色劑30 %乙醇黃酮標準溶液脫色除脂加入石油醚黃酮水溶液 1蒸餾回收乙醇提取液乙醇回流提取粉碎決明子粉末 17 測量設(shè)定數(shù)顯恒溫水浴鍋 圖 22 提取裝置 圖 23 蒸餾裝置 18 實驗方案 1. 標準溶液的配制和標準曲線制作 將蘆丁于 120℃ 下干燥至恒重，準確稱取蘆丁標準樣品 ，用 30％乙醇溶解，定溶于 100mL，得濃度為 。準確吸取蘆丁標準液 0mL、 、 、 、 、 10mL容量瓶中，加入 5%NaNO2液 ，搖勻，放置 6min后加入 10%Al(N03)3溶液 ，搖勻，放置 6min后加入 4%NaOH溶液 ，再用 30%乙醇定容，搖勻，以 30%乙醇為空白參比 ， l0min后用 lcm比色皿于 510nm測定吸光度 A，得到蘆丁標樣含量 Y(μg/mL)與吸光度 A間的關(guān)系，畫出標準曲線 [17]。 2. 決明子中黃酮平均含量的提取及測定 決明子中總黃酮平均含量的測定。分 3次分別準確稱取 ，用濾紙包住并用棉線捆好，置于索氏提取器中，用 100mL甲醇體積濃度 75％， 80℃ 水浴加熱回流，當索氏提取器中的 溶液由黃色接近無色時，取出用濾紙包住的決明子粉末，蒸餾回收甲醇至近干，加水約 80mL溶解，加入 20mL石油醚脫色 2次，棄去醚層。加水于 100mL容量瓶中定容，作為待測液 [17]。取待測液 10mL于 50mL容量瓶中，用 30％乙醇定容，取 10mL容量瓶中，以下按照測定蘆丁標準液吸光度的方法測定吸光度 A。重復 3次，結(jié)果取平均值 [18]。從決明子中提取的黃酮含量可按下列公式計算： M(%)=[Y(100/10)(50/2)1010 6100]/w 式中： 100/10 和 50/2—稀釋倍數(shù)； w—決 明子重 (g)。提取率 (%)=(提取黃酮含量 /決明子中總黃酮的平均含量 )100[18]。 3. 決明子中總黃酮的提取及測定 準確稱取 ，按照設(shè)計的配方加入一定量的提取劑，在一定溫度下回流提取一定時間，趁熱減壓抽濾，濾渣加適量水洗滌、過濾．合并清液后得提取液，再蒸餾，回收溶劑至近干，再按照 2中的步驟配置待測液，以下按照測定蘆丁標準液吸光度的方法測定吸光度 A，計算黃酮提取率 [19]。 4. 提取溶劑的選擇 分別用沸水、堿性水溶液 (pH值 )、 75％乙醇溶液、 75％甲醇溶液、 75％丙酮溶液 [16]，80℃ 水浴下，回流浸提 ，料液比為 1:20分別提取，測定其吸光度，計算其提取率分別。 5. 影響提取效果的因素 (1) 乙醇濃度對浸提效果的影響 分別采用 65%、 75%、 80%、 85%、 95%的乙醇濃度按 3的操作步驟進行試驗，在 80℃ 下，回流提取時間為 ，料液比為 1:20，提取決明子中黃酮類化合物的試驗，得出乙醇濃度對提取效果的影響。 (2) 提取溫度對浸提效果的影響 分別采用 50℃ 、 60℃ 、 70℃ 、 80℃ 、 90℃ 、的提取溫度 [16]按 3的操作步驟進行試驗，以 19 濃度為 75%的乙醇為提取劑，回流提取時間為 ，料液比為 1:20，提取決明子中黃酮類化合物的試驗，得出提取溫度對提取效果的影響。 (3) 料液比對浸提效果的影響 分別采用 1: 1: 1:2 1: 1:35(g:mL)的料液比例按 3的操作步驟進行試驗，以濃度為 75%的乙醇為提取劑，回流提取時間為 ，提取溫度為 80℃ 時，提取決明子中黃酮類化合物的試驗，得出料液比對提取效果的影響。 (4) 提取時間對浸提效果的影響 分別采用 、 、 、 、 3的操作步驟進行試驗，以濃度為75%的乙醇為提取劑，提取溫度為 80℃ ， 料液比為 1:20，提取決明子中黃酮類化合物的試驗，得出提取時間對提取效果的影響。 單因素實驗條件見表 23所示。 表 23 單因素實驗條件表 乙醇濃度 提取溫度 料液比 提取時間 恒溫水浴 80℃ 75%濃度乙醇 75%