【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 分。研究表明， BAI對(duì)多種革蘭染色陽(yáng)性菌、革蘭染色陰性菌及螺旋體等均有抑制作用。 黃芩也具有抗真菌活性，對(duì)多種致病性真菌，如白色念珠菌，許蘭毛癬菌等有一定抑制作用。近來(lái)研究顯示， BAI還具有抗艾滋病病毒 HIV的作用，能誘導(dǎo)感染 HIV的細(xì)胞發(fā)生凋亡。 (7) 降血糖血脂作用 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明葛根黃酮、飛薊素等具有有降血脂和降低膽固醇的作用。它們可顯著降低四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的血糖和血清膽固醇水平，降低胰島的 MDA水平，升高 血和胰島的谷光甘肽 (GSH)水平。麥胚黃酮卷柏黃酮可降低糖尿病大鼠血清過(guò)氧化脂含量，增強(qiáng)谷光甘肽過(guò)氧化酶的活力。其作用機(jī)制與清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)抗四氧嘧啶所致的 β 細(xì)胞損傷促進(jìn) β 細(xì)胞修復(fù)和再生密切相關(guān)。此外枸杞黃酮等也有降血脂的作用。 (8) 黃酮類(lèi)化合物在食品方面的應(yīng)用 除了作為藥物使用以外，在食品工業(yè)上，也把它作為功能食品的添加劑、天然抗氧化劑、天然色素和天然甜味劑等等。近年來(lái)上市的保健產(chǎn)品中，大部分功效成分都屬于黃酮類(lèi)化合物。從加工過(guò)程看主要有兩種形式，一種是用富含黃酮類(lèi)的原料直接加工成食品，在加工過(guò)程中最大程度地保留有效成分；另一種是從原料中提取出黃酮類(lèi)物質(zhì)，再把他添加到其他原料中進(jìn)行加工制成產(chǎn)品。 決明子中黃酮類(lèi)化合物提取方法 黃酮提取的方法很多，主要是根據(jù)黃酮化合物的結(jié)構(gòu)與來(lái)源的不同，溶解性差異較大，因此，應(yīng)根據(jù)其極性和水溶性的大小選擇合適的溶劑進(jìn)行提取。目前，對(duì)苷類(lèi)和極性較大的苷元，常用某些極性較大的混合溶劑 (如甲醇～水 (1： 1)、水、甲醇、乙醇、丙酮進(jìn)行提取，而對(duì)大多數(shù)苷元?jiǎng)t采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯等極性小的溶劑進(jìn)行提取。 12 決明子中黃酮類(lèi)化合物為極性較大的甘元，所以主要用有機(jī)溶劑提取法 、微波提取法等方法。生物酶法提取植物中黃酮的提取效果好、提取率高，已被廣泛應(yīng)用 15。 (1) 水提法 水提法僅限于黃酮苷類(lèi)物質(zhì)，在提取的過(guò)程中要考慮加水量、浸泡時(shí)問(wèn)、攪拌速度、煎煮時(shí)間及煎煮次數(shù)等因素。此工藝成本低、安全、設(shè)備簡(jiǎn)單，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，但是用水提取時(shí)，提取中雜質(zhì)較多 (如無(wú)機(jī)鹽、蛋自質(zhì)、糖類(lèi)等 )，后續(xù)分離麻煩?，F(xiàn)在，很少單一使用本方法。 (2) 堿性水或堿性稀醇提取法 黃酮類(lèi)物質(zhì)大多具有酚羥基，因此可以用堿水或堿性稀醇浸出，經(jīng)酸化后得出黃酮類(lèi)物質(zhì)。主要用堿性溶液是吸氫氧化鈉和石灰水 (氫氧化鈣水溶液 )。氫氧化鈉水溶 液的浸出能力高，但雜質(zhì)較多不利于純化。石灰水可以使～些鞣質(zhì)和水溶性雜質(zhì)沉淀生成鈣鹽沉淀，但浸出效果不如氫氧化鈉水溶液效果好，同時(shí)有些黃類(lèi)化合物能與鈣結(jié)合成不溶性物質(zhì)，不被溶出。一般可以根據(jù)不同的原料使用不同堿性溶液。 (3) 有機(jī)溶劑提取法 這是國(guó)內(nèi)外使用最廣泛的方法。有機(jī)溶劑主要用乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇等。此方法主要用于提取脂溶性基團(tuán)占優(yōu)勢(shì)的黃酮類(lèi)物質(zhì)，對(duì)設(shè)備要求簡(jiǎn)單，產(chǎn)品得率高，但成本較高，雜質(zhì)含量也較高。常見(jiàn)的可以分為三種方法：冷浸法、滲漉法、回流法。有機(jī)溶劑提取中最常使用的溶劑是乙醇，乙醇的濃度對(duì)總黃酮的 提取有較大的影響。一般來(lái)說(shuō)，乙醇的濃度增高有利于總黃酮的提取，但也不是絕對(duì)的，有時(shí)還與黃酮類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)有關(guān)，高濃度的乙醇適用于提取黃酮苷元類(lèi)，的濃度乙醇適用于提取黃酮苷類(lèi)。本方法經(jīng)常與液—— 液萃取法、吸附洗脫法相結(jié)合，能得到更高純度的精制物。 (4) 微波法 微波技術(shù)在中草藥的應(yīng)用上越來(lái)越廣泛，原理是利用磁控管所產(chǎn)生的每秒 24． 5億次超高頻率的快速震動(dòng)，使藥材內(nèi)分子問(wèn)相互碰撞、擠壓，有利于藥材有效成分的浸出。此法對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取也取得了不錯(cuò)的效果，具有反應(yīng)高效性和強(qiáng)選擇性等特點(diǎn)，操作簡(jiǎn)單、副產(chǎn)物少，產(chǎn)率高及產(chǎn)物易 提純等優(yōu)點(diǎn)。浸出過(guò)程中中藥材細(xì)粉不凝聚、不襁化，克服了熱水法易凝聚、糊化的不足。 (5) 酶解法 對(duì)于一些黃酮類(lèi)物質(zhì)被細(xì)胞壁包圍不易提取的原料使用酶解的法比較實(shí)用。原理是沒(méi)能夠充分破壞以纖維索為主的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及其細(xì)胞間相連的果膠，使植物中的果膠完全能夠分解成小分子物質(zhì)，減小提取的傳質(zhì)阻力，是植物中的黃酮 類(lèi)物質(zhì)能夠充分地釋放出來(lái)。 (6) 超臨界萃取法 13 超臨界 C02萃取技術(shù)是以液態(tài) C02為溶劑進(jìn)行提取的，是一種不同于傳統(tǒng)黃酮類(lèi)物質(zhì)提取的新工藝，它的提取率與提取溫度、提取壓力、 C02消耗量等因素有關(guān)。與其它工藝相比較，該技術(shù) 具有提取率高、無(wú)殘留溶劑、無(wú)污染，活性成分和熱不穩(wěn)定成分不易被分解破壞而保持天然特征，此技術(shù)為中草藥有效成分的熱敏性物質(zhì)的提取研究開(kāi)辟一條新路。同時(shí)，還可以通過(guò)控制臨界溫度和壓力達(dá)到選擇性提取和分離純化的目的。缺點(diǎn)是超臨界提取所需設(shè)備價(jià)格昂貴、生產(chǎn)成本高、提取物中烷基酚含量較高、對(duì)極性大的物質(zhì)提取不理想。目前還難以進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)，但本法在生產(chǎn)銀杏黃酮的技術(shù)上取得了重大突破 . 黃酮類(lèi)化合物的常用分析側(cè)定方法 (1) 比色法 這是分析提取物總黃酮含量最普遍的方法。通常采用的顯色方法有以下兩種 [16]： 亞硝酸鈉 硝酸鋁顯 色法 以蘆丁為標(biāo)樣，將一定量提取液置 25mL比色管中，用 30％ (v/v)乙醇補(bǔ)充至 ，加入 ％ NaNO2，搖勻，靜止 5min后加入 ％ Al(NO3)3， 6min后再加入 5mL4％ NaOH，搖勻，用 30％ (v/v)L醇稀釋至刻度， 10rain后于 510nm進(jìn)行比色。 AlCl3顯色法 以蘆丁為標(biāo)樣，在測(cè)定液中加入 AlCl3搖勻，室溫放置 10min，按分光光度法，在 200500nm范圍內(nèi)迸行掃描，尋找二者重疊最吸收波長(zhǎng)，測(cè)定。 兩種方法機(jī)理不同，亞硝酸鈉 硝酸鋁顯色原理文獻(xiàn) 認(rèn)為是蘆丁 NaNO2Al(NO3)3NaOH試劑在蘆丁 B環(huán)的 3’,4鄰二酚羥基部位反應(yīng)產(chǎn)生紅色物質(zhì)。 AlCl3顯色法原理是 Al3+與 3或5fE基與 4羥基，或者 B環(huán)的 3’,4二鄰二酚羥基絡(luò)合顯色。 (2) 紫外法 采用標(biāo)準(zhǔn)品與提取液在紫外區(qū)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)，制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定總黃酮含量 (3) HPLC 法 在銀杏 、花生殼的 黃酮定量中，由于黃酮苷較多，多采用酸水解成苷元，在 測(cè) 定總黃酮的方法中，大多采用榭皮素作對(duì)照品，也有用懈皮素、山奈酚和異鼠李素三種作為對(duì)照品。 研究的目的與內(nèi)容 本文的研究目的是應(yīng)用有機(jī)溶劑萃取 方法，提取決明子中黃酮類(lèi)化合物。 重點(diǎn) 研究不同提取條件對(duì) 黃酮提取效率的影響，確定其影響程度的大小，尋找最佳提取工藝條件。 本論文的 研究包括以下內(nèi)容： (1) 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。 (2) 決明子中黃酮總含量的測(cè)定。 (3) 不同提取劑對(duì)決明子中黃酮浸提效果的影響。 14 (4) 乙醇濃度對(duì)決明子 中 黃酮浸提效果的影響 。 (5) 提取 溫度對(duì)決明子 中 黃酮浸提效果的影響 。 (6) 提取時(shí)間對(duì)決明子 中 黃酮浸提效果的影響 。 (7) 料液比對(duì)決明子 中 黃酮浸提效果的影響 。 (8) 進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取條件。 15 第 2章 實(shí)驗(yàn)部分 黃酮類(lèi)化合物的溶解度與黃酮苷元的結(jié)構(gòu)及其配基的不同而有很大的差異，一 般游離苷元難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑中。黃酮類(lèi)苷元分子中引入的羥基越多，其溶解度越大。黃酮類(lèi)化合物的羥基糖苷元化后，水溶解度較大，而在一些較低極性的有機(jī)溶劑中溶解度較低。黃酮苷一般易溶于水、乙醇、甲醇等強(qiáng)極性的溶劑中；難溶于或不溶于苯、氯仿等有機(jī)溶劑中。糖鏈越長(zhǎng)，則水溶解度越大。 儀器與藥品 實(shí)驗(yàn)儀器 表 21 實(shí)驗(yàn)儀器 名稱(chēng) 型號(hào) 生產(chǎn)廠家 循環(huán)水式多用真空泵 SHB—Ⅲ 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司 電子恒溫不銹鋼水浴鍋 HHS—2S 上海市南陽(yáng)儀器有限公司 可見(jiàn)分光光度計(jì) 722N 上海精科電子有限公司 調(diào)溫電加熱套 DZHW 河北省黃驊市中興儀器有限公司 電子天平 AW220 慈溪市天東衡器廠 大功率粉碎機(jī) QE—100 武漢縣工具有限公司 索氏提取器 天津北辰區(qū)光明儀器廠 蒸餾裝置 M22 型中量 天津玻璃儀器廠 電熱干燥箱 202—3 北京金北德工貿(mào)有限公司 實(shí)驗(yàn)藥品 選用決明子在北吉大藥房購(gòu)得，產(chǎn)地為廣西省。 16 表 22 實(shí)驗(yàn)藥品 名稱(chēng) 分子式 純度 生產(chǎn)廠家 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) C27H30O16 西安旭煌生物技術(shù)有限公司 95%乙醇 CH3CH2OH 天津永晟精細(xì)化工有限公司 無(wú)水甲醇 CH3OH 天津光復(fù)精細(xì)化工研究所 丙酮 CH3COCH 天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司 石油醚 天津永晟精細(xì)化工有限公司 亞硝酸鈉 NaNO2 天津永晟精細(xì)化工有限公司 硝酸鋁 Al2(NO3)39H2O 天津永晟精細(xì)化工有限公司 氫氧化鈉 NaOH 天津永晟精細(xì)化工有限公司。 實(shí)驗(yàn) 過(guò)程 實(shí)驗(yàn)流程及裝置圖 實(shí)驗(yàn)流程如圖 21 所示。 圖 21 黃酮提取實(shí)驗(yàn)流程 實(shí)驗(yàn)所用儀器裝置見(jiàn) 圖 22.、 23 吸光度 A中藥決明子測(cè)定吸光度黃酮水溶液 2加入顯色劑30 %乙醇黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液脫色除脂加入石油醚黃酮水溶液 1蒸餾回收乙醇提取液乙醇回流提取粉碎決明子粉末 17 測(cè)量設(shè)定數(shù)顯恒溫水浴鍋 圖 22 提取裝置 圖 23 蒸餾裝置 18 實(shí)驗(yàn)方案 1. 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 將蘆丁于 120℃ 下干燥至恒重，準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品 ，用 30％乙醇溶解，定溶于 100mL，得濃度為 。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0mL、 、 、 、 、 10mL容量瓶中，加入 5%NaNO2液 ，搖勻，放置 6min后加入 10%Al(N03)3溶液 ，搖勻，放置 6min后加入 4%NaOH溶液 ，再用 30%乙醇定容，搖勻，以 30%乙醇為空白參比 ， l0min后用 lcm比色皿于 510nm測(cè)定吸光度 A，得到蘆丁標(biāo)樣含量 Y(μg/mL)與吸光度 A間的關(guān)系，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線 [17]。 2. 決明子中黃酮平均含量的提取及測(cè)定 決明子中總黃酮平均含量的測(cè)定。分 3次分別準(zhǔn)確稱(chēng)取 ，用濾紙包住并用棉線捆好，置于索氏提取器中，用 100mL甲醇體積濃度 75％， 80℃ 水浴加熱回流，當(dāng)索氏提取器中的 溶液由黃色接近無(wú)色時(shí)，取出用濾紙包住的決明子粉末，蒸餾回收甲醇至近干，加水約 80mL溶解，加入 20mL石油醚脫色 2次，棄去醚層。加水于 100mL容量瓶中定容，作為待測(cè)液 [17]。取待測(cè)液 10mL于 50mL容量瓶中，用 30％乙醇定容，取 10mL容量瓶中，以下按照測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的方法測(cè)定吸光度 A。重復(fù) 3次，結(jié)果取平均值 [18]。從決明子中提取的黃酮含量可按下列公式計(jì)算： M(%)=[Y(100/10)(50/2)1010 6100]/w 式中： 100/10 和 50/2—稀釋倍數(shù)； w—決 明子重 (g)。提取率 (%)=(提取黃酮含量 /決明子中總黃酮的平均含量 )100[18]。 3. 決明子中總黃酮的提取及測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取 ，按照設(shè)計(jì)的配方加入一定量的提取劑，在一定溫度下回流提取一定時(shí)間，趁熱減壓抽濾，濾渣加適量水洗滌、過(guò)濾．合并清液后得提取液，再蒸餾，回收溶劑至近干，再按照 2中的步驟配置待測(cè)液，以下按照測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的方法測(cè)定吸光度 A，計(jì)算黃酮提取率 [19]。 4. 提取溶劑的選擇 分別用沸水、堿性水溶液 (pH值 )、 75％乙醇溶液、 75％甲醇溶液、 75％丙酮溶液 [16]，80℃ 水浴下，回流浸提 ，料液比為 1:20分別提取，測(cè)定其吸光度，計(jì)算其提取率分別。 5. 影響提取效果的因素 (1) 乙醇濃度對(duì)浸提效果的影響 分別采用 65%、 75%、 80%、 85%、 95%的乙醇濃度按 3的操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，在 80℃ 下，回流提取時(shí)間為 ，料液比為 1:20，提取決明子中黃酮類(lèi)化合物的試驗(yàn)，得出乙醇濃度對(duì)提取效果的影響。 (2) 提取溫度對(duì)浸提效果的影響 分別采用 50℃ 、 60℃ 、 70℃ 、 80℃ 、 90℃ 、的提取溫度 [16]按 3的操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，以 19 濃度為 75%的乙醇為提取劑，回流提取時(shí)間為 ，料液比為 1:20，提取決明子中黃酮類(lèi)化合物的試驗(yàn)，得出提取溫度對(duì)提取效果的影響。 (3) 料液比對(duì)浸提效果的影響 分別采用 1: 1: 1:2 1: 1:35(g:mL)的料液比例按 3的操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，以濃度為 75%的乙醇為提取劑，回流提取時(shí)間為 ，提取溫度為 80℃ 時(shí)，提取決明子中黃酮類(lèi)化合物的試驗(yàn)，得出料液比對(duì)提取效果的影響。 (4) 提取時(shí)間對(duì)浸提效果的影響 分別采用 、 、 、 、 3的操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，以濃度為75%的乙醇為提取劑，提取溫度為 80℃ ， 料液比為 1:20，提取決明子中黃酮類(lèi)化合物的試驗(yàn)，得出提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響。 單因素實(shí)驗(yàn)條件見(jiàn)表 23所示。 表 23 單因素實(shí)驗(yàn)條件表 乙醇濃度 提取溫度 料液比 提取時(shí)間 恒溫水浴 80℃ 75%濃度乙醇 75%