【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 發(fā)皿放在60℃的水浴鍋上通風(fēng)揮發(fā)近干（切勿蒸干）。在蒸發(fā)皿中加入二硫化碳，用小玻璃棒少量多次洗滌蒸發(fā)皿中殘留物，轉(zhuǎn)移到2mL容量瓶中，試液作為試樣測(cè)定液。 色譜柱條件[14] 色譜柱：玻璃柱，內(nèi)徑3mm,長(zhǎng)3m，內(nèi)裝涂有2%OV1固定液的酸洗硅烷化處理的白色硅藻土載體（Chromosorb W AW DMCS）,粒度80100目。檢測(cè)器溫度：250℃，汽化室溫度：160℃，柱溫：250℃。氮?dú)猓∟2）：30mL/min，氫氣（H2）：50mL/min，空氣：600mL/min。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的配制 （1mg/mL），用二硫化碳定容，、50ug/mL、 ug/mL、150 ug/mL、200 ug/mL、250 ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用一次性吸管將上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液裝入樣品瓶中，放入氣相色譜的滑槽中，準(zhǔn)備進(jìn)樣。 標(biāo)品進(jìn)樣檢測(cè) 打開(kāi)電源總開(kāi)關(guān)，打開(kāi)氣閥設(shè)置氣壓，氫氣（H2）：，氮?dú)猓∟2）：，空氣：。打開(kāi)氣相色譜儀開(kāi)關(guān)，并打開(kāi)軟件工作站，聯(lián)機(jī)進(jìn)行開(kāi)始進(jìn)樣。開(kāi)始進(jìn)樣前若玻璃柱長(zhǎng)久未用，一定要將柱子進(jìn)行老化。老化的方法多采用氣體流動(dòng)法,將柱入口與進(jìn)樣室相連,出口勿接檢測(cè)器,通小流量(一般為510mL/min)的載氣,以(24)℃/min程序升溫至低于固定液最高使用溫度2030℃,老化1224h,獲得平穩(wěn)基線,待基線穩(wěn)定后，便可以開(kāi)始進(jìn)樣。根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行定性，根據(jù)峰面積進(jìn)行定量。根據(jù)不同濃度的標(biāo)品即可繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣品含量測(cè)定 ，利用一次性吸管將用二硫化碳定容的樣品溶液裝入樣品瓶中，氣相自動(dòng)進(jìn)樣。根據(jù)上述的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)出峰的保留時(shí)間和出峰的面積，即可得出樣品中TBHQ的含量。 樣品預(yù)處理優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)依國(guó)標(biāo)方法（GB/）中的測(cè)定油脂中TBHQ（叔丁基對(duì)苯二酚）的方法的基礎(chǔ)之上對(duì)菜籽油中TBHQ測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)研究，主要是對(duì)油脂預(yù)處理方面進(jìn)行改變處理，獲得最佳的檢測(cè)效果的預(yù)處理?xiàng)l件，最后對(duì)該方法的檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法的檢測(cè)結(jié)果在準(zhǔn)確度和精密度方面進(jìn)行對(duì)照比較，驗(yàn)證該方法的可行性。 提取溶劑選擇 本實(shí)驗(yàn)是在國(guó)標(biāo)方法中采用乙醇作為提取溶劑的基礎(chǔ)上，研究再采用有機(jī)溶劑甲醇、乙腈分別對(duì)植物油中的TBHQ進(jìn)行提取，并采用加標(biāo)回收的方法確定三種溶劑對(duì)植物油的提取效果。具體操作步驟：吸取2mL的菜籽油，分別加入100ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)品2mL，分別吸取5mL的甲醇、乙醇和乙腈對(duì)菜籽油進(jìn)行提取，每個(gè)樣品平行做五次，然后用氣相色譜進(jìn)行自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算比較計(jì)算結(jié)果，回收率較好者為最佳。 提取條件優(yōu)化在上述得出最佳的提取溶劑后，在本實(shí)驗(yàn)可能影響到抗氧化劑的因素有提取溶劑的總體積、混勻時(shí)間、溶劑提取次數(shù)和水浴溫度，采用加標(biāo)回收的方法，均在樣品中加入100ug/mL的TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品2mL。 單因素實(shí)驗(yàn)（1）提取溶劑體積 選取提取溶劑分別為2mL、4mL和6mL和8mL的乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行提取三次，按照 ，其他條件不變，測(cè)定其回收率（2） 混合時(shí)間 分別選取混合時(shí)間分別為1min、3min和5min，其他條件不變，測(cè)定其回收率。 （3） 提取次數(shù) 分別選取提取次數(shù)為2和3，其他條件不變，測(cè)定其回收率。（4） 水浴溫度 分別選取水浴溫度為60℃、70℃、80℃、90℃和100℃，其他條件不變，測(cè)定其回收率。（5） 水浴時(shí)間 分別選取水浴時(shí)間為10s、20s、30s和40s，其他條件不變，測(cè)定其回收率。 正交試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溶劑的體積、混合時(shí)間、提取次數(shù)和水浴溫度四個(gè)因素水平進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，采取加標(biāo)回收的方法得出最佳的溶劑提取條件，使樣品預(yù)處理?xiàng)l件為最優(yōu)。本實(shí)驗(yàn)采用L9(3)進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)[15]見(jiàn)下表：表23 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平編碼表水平試驗(yàn)因素溶劑體積/mL A混合時(shí)間/min B提取次數(shù) C水浴溫度/℃ D12 1110024 228036 3360 實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)定 精密度測(cè)定精密度：指在相同條件下N次重復(fù)測(cè)定結(jié)果彼此相符合的程度。精密度大小用偏差表示，偏差越小，精密度越高。本實(shí)驗(yàn)直接采用標(biāo)準(zhǔn)樣品的精密度對(duì)其方法進(jìn)行判定。其操作步驟如下： 采用國(guó)標(biāo)方法精密度測(cè)定 吸取TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為50ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL的溶液2mL于25mL比色管中，加入5mL 80%乙醇溶液，振搖1min，靜置片刻，放入90℃的水浴中加熱30s，促其分層。分層后，將上清液用移液管轉(zhuǎn)移到60mL的瓷蒸發(fā)皿中，再用5mL的80%的乙醇溶液重復(fù)提取兩次，提取液一并倒入蒸發(fā)皿中，將蒸發(fā)皿放在60℃的水浴鍋上通風(fēng)揮發(fā)近干（切勿蒸干）。在蒸發(fā)皿中加入二硫化碳，用小玻璃棒少量多次洗滌蒸發(fā)皿中殘留物，轉(zhuǎn)移到2mL容量瓶中，試液作為試樣測(cè)定液。，每個(gè)組每個(gè)濃度平行做七次，測(cè)定其濃度含量，計(jì)算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。 采用優(yōu)化后方法精密度測(cè)定 吸取TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為50ug/mL、100 ug/mL、200 ug/mL的溶液2mL于25mL比色管中，采用優(yōu)化后的條件，即加入6mL 80%的乙醇溶液，振搖2min，然后再用6mL的乙醇溶液提取一次，放入80℃的水浴鍋中水浴30s，其它條件與國(guó)標(biāo)方法相同。，每個(gè)組每個(gè)濃度平行做七次，測(cè)定其濃度含量，計(jì)算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。將兩者測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較對(duì)照，確定哪種方法更為準(zhǔn)確。 回收率測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用加標(biāo)回收的方法測(cè)定回收率[16] 采用國(guó)標(biāo)方法測(cè)定回收率 用移液管分別取TBHQ標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100mg/mL、150 mg/mL、250 mg/mL各2mL于25mL的比色管中，并在比色管中加入2mL的樣品（即菜籽油）溶液，加入5mL的80%乙醇溶液（80%乙醇是將95%乙醇80mL和15mL蒸餾水混合配置而成）。振搖1min，靜置片刻，放入90℃左右的水浴中加熱30s，待其分層。分層后，將上層澄清提取液用吸管轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中（切勿將油滴帶入）。再用5mL的80%乙醇溶液重復(fù)提取兩次。提取液一并加入到蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放入60℃的水浴上通風(fēng)揮發(fā)或自然揮發(fā)至近干（切勿蒸干）并同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)[17]。在蒸發(fā)皿中加入二硫化碳，用小玻璃棒少量多次洗滌蒸發(fā)皿中殘留物，轉(zhuǎn)移到2mL容量瓶中，試液作為試樣測(cè)定液。每個(gè)加標(biāo)濃度做六次平行試驗(yàn)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線查出樣品加標(biāo)回收的濃度，取平均值并計(jì)算回收率[18]。 采用優(yōu)化處理方法測(cè)定回收率 用移液管分別吸取TBHQ標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100mg/mL、150 mg/mL、250 mg/mL各2mL于25mL的比色管中，并在比色管中加入2mL的樣品（即菜籽油）溶液，采用優(yōu)化后的條件，即加入6mL 80%的乙醇溶液，振搖2min，然后再用6mL的乙醇溶液提取一次，放入80℃的水浴鍋中水浴30s，其它條件與國(guó)標(biāo)方法相同。每個(gè)加標(biāo)濃度也是平行做六次，計(jì)算回收率。將兩種方法測(cè)定的回收率進(jìn)行比較對(duì)照。3結(jié)果與分析（TBHQ）的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用國(guó)標(biāo)方法，將標(biāo)準(zhǔn)樣品稀釋成濃度為50ug/mL、100ug/mL、150ug/mL、200ug/mL、250ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，采用氣相自動(dòng)進(jìn)樣，測(cè)得結(jié)果以濃度（ug/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積（UV*S）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其結(jié)果見(jiàn)表31和圖31。 表31 標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積表 濃度(ug/mL) 峰面積（UV*S） 69094 127370 193676 240462 319013圖31 TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線其標(biāo)品的回歸方程為y=（ ）*X，R2=，表明該曲線的線性相關(guān)性較好，可以作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。 樣品中含量的測(cè)定，平行做三組，可以根據(jù)色譜圖上的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算出樣品中TBHQ的含量，色譜圖中以箭頭來(lái)表示。其濃度與峰面積見(jiàn)表32和色譜圖見(jiàn)圖32：表32 樣品（菜籽油）濃度與峰面積樣品標(biāo)號(hào)出峰時(shí)間(min)濃度（ug/min）峰面積（UV