【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 記的由短鏈核苷酸組成的大分子（即一段比較短的 DNA或 RNA），能與被檢測(cè)長(zhǎng)鏈 DNA或 RNA進(jìn)行分子雜交，且雜交后可由該分了上的標(biāo)記顯示目的長(zhǎng)鏈 DNA或 RNA分子的存在。 常用寡核苷酸探針的標(biāo)記物 放射性同位素標(biāo)記： 32P、 33P、 35S 非放射性標(biāo)記： 生物素、地高辛 生物素－ dUTP、生物素－ dATP、地高辛－ dUTP等 基因工程－－第四章 基因操作過程 雜交探針的標(biāo)記： ABC熒光標(biāo)記 基因工程－－第四章 基因操作過程 雜交探針的標(biāo)記： ABC顯色酶標(biāo)記 基因工程－－第四章 基因操作過程 地高辛－ dUTP 雜交探針的標(biāo)記： 地高辛系統(tǒng)標(biāo)記 基因工程－－第四章 基因操作過程 兩種地高辛－ dUTP顯色系統(tǒng) 基因工程－－第四章 基因操作過程 DIG探針雜交過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 雜交探針的制備： 用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件： 單鏈結(jié)構(gòu) （ 雙鏈 DNA可用堿變性 ） 足夠長(zhǎng)度 （ 至少 12個(gè) 堿基 ） 內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū) 探針的制備方法或來源包括： 人工合成 cDNA合成 同源序列 mRNA GACCTA AAGCGGATCG TAGGTC GACCTA CTGGAT A A G C T G G G C A 基因工程－－第四章 基因操作過程 T4PNP介導(dǎo)的末端標(biāo)記 探針的標(biāo)記方法 切口移位 (平移 )法 引物延伸法 末端標(biāo)記法 體外轉(zhuǎn)錄或反錄法 ① 末端標(biāo)記 TdT介導(dǎo)的末端標(biāo)記 T4Pol介導(dǎo)的末端標(biāo)記 基因工程－－第四章 基因操作過程 ② DNA聚合酶 介導(dǎo)的 切口平移 標(biāo)記 基因工程－－第四章 基因操作過程 ③ DNA聚合酶 介導(dǎo)的 隨機(jī)引物法 基因工程－－第四章 基因操作過程 ④ 逆轉(zhuǎn)錄酶 介導(dǎo)的 反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 3’ AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT 5’ mRNA 反轉(zhuǎn)錄酶 Mg2+ dNTP + pppdATP （ a32PdATP） 5’ TTTTTTTTTTT 5’ mRNA 3’ cDNA 3’ AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT 5’ TTTTTTTTTTTGGTCGAAGGCTTGACTAAATCCGA 基因工程－－第四章 基因操作過程 轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 基因工程－－第四章 基因操作過程 原位雜交 (insitu hybridization) 菌落或噬菌斑雜交，將生長(zhǎng)在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來的位臵不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用 基本程序是：將被篩選的 大腸桿菌菌落或噬菌斑 ，從其生長(zhǎng)的瓊脂平板中 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜 上，進(jìn)行適當(dāng)?shù)?溫育 ，保藏原來的菌落平板作為參照，以便從中 挑取陽(yáng)性克隆 。 基因工程－－第四章 基因操作過程 復(fù)制平板和膜轉(zhuǎn)印時(shí)應(yīng)在平板和膜上的一側(cè)做三個(gè)對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽 ① ②酸中和 ③蛋白酶處理 ④漂洗細(xì)胞碎片 ⑤ 80℃ 烘烤 與 32P標(biāo)記的探針雜交 放射性自顯影 在參照平板上挑取目標(biāo)陽(yáng)性克?。?yáng)性菌落）擴(kuò)大培養(yǎng) 菌落原位雜交 基因工程－－第四章 基因操作過程 噬菌斑原位雜交 基因工程－－第四章 基因操作過程 Southern 雜交(Southern blotting ) 目標(biāo) DNA 經(jīng)過限制性酶切并通過瓊脂糖凝膠電泳 ① NaOH 變性 ② NaCl/1M Tris（ ） 中和 ③使 DNA 仍保持單鏈狀態(tài) ① 將凝膠上的 DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上 ②通過 80℃ 處理或紫外線照射將 DNA 固定在濾膜上 將結(jié)合了 DNA 分子的濾膜先與特定的預(yù)雜液進(jìn)行 預(yù)雜交 ， 將濾膜的空白處用魚精 DNA 或牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過程中濾膜本身對(duì)探針的吸附 雜交 ：在一定的溶液條件和溫度下，將標(biāo)記的核酸探針與濾膜混合，如果濾膜上的 DNA 分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸附在濾膜上 洗膜 ：經(jīng)過一定的洗滌程序?qū)⒂坞x的探針分子除去 檢測(cè)： 放射性標(biāo)記、檢測(cè) 非放射性標(biāo)記、檢測(cè) 基因工程－－第四章 基因操作過程 分子雜交爐 紫外交聯(lián)儀 基因工程－－第四章 基因操作過程 M，地高辛（ DIG）標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)（ λDNA/ HindⅢ ） 13，蘇云金芽胞桿菌 YBT1520 菌株的總 DNA 分別經(jīng) KpnⅠ PstⅠ 、 PstⅠ 和 Kpn Ⅰ 酶切 以 cry1Aa 殺蟲晶體蛋白基因中的 728bp 片段作探針，通過隨機(jī)引物標(biāo)記的方式，用 DIG 標(biāo)記探針 基因工程－－第四章 基因操作過程 Northern 雜交 (Northern blotting ) (A) RNA is isolated from various tissues and is separated by size using gel electrophoresis. (B) The gel is then placed on a paper wick, which absorbs an ionic solution from a trough (C) A filter that traps RNA is placed above the gel, and blotting paper is placed above the filter. Capillary action draws the solution through the gel, trapping the RNA on the filter (D) The filter is incubated with radioactive singlestranded DNA plementary to the mRNA of interest (E) After any unbound DNA is washed off, autoradiography localizes the mRNA in the samples that contain it. (F) Drawing of a developmental Northern blot showing the presence of Pax6 mRNA in the eye, brain, and pancreas of a mammalian embryo 基因工程－－第四章 基因操作過程 雙脫氧法測(cè)序 (Sanger dideoxy procedure ) 4 DNA序列的測(cè)定 (Sanger dideoxy procedure ) 大規(guī)模測(cè)序的策略和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展 化學(xué)法測(cè)序 (MaxamGilbert procedure) 基因工程－－第四章 基因操作過程 Frederick Sanger DNA的合成過程中，在合成的 DNA鏈的 3′末端，依據(jù)堿基配對(duì)的原則，通過生成新的 3′， 5′磷酸二酯鍵，使 DNA鏈合成終止，產(chǎn)生短的 DNA鏈。產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長(zhǎng)度的、不同長(zhǎng)短的 DNA鏈。 雙脫氧法測(cè)序 (Sanger dideoxy procedure ) ① 雙脫氧法測(cè)序 原理 基因工程－－第四章 基因操作過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 雙脫氧法測(cè)序基本過程 基因工程－－第四章 基因操作過程 自動(dòng)測(cè)序電泳裝置 基因工程－－第四章 基因操作過程 An example of a portion of a chromatogram from automated sequencing Automated sequencing is based on the dideoxy methodology, but four different fluorescent dyelabelled ddNTPs are used. Thus each fluorescent label can be detected by its characteristic spectrum. The products are separated by automated electrophoresis and the bands detected by fluorescence spectroscopy. 基因工程－－第四章 基因操作過程 Sanger測(cè)序儀采用 96個(gè)毛細(xì)電泳管的陣列，可以同時(shí)進(jìn)行 96個(gè)這樣的測(cè)序反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)得到的 Read長(zhǎng)度可以達(dá)到 1000bp以上 MEGABACE1000 DNA測(cè)序 儀 基因工程－－第四章 基因操作過程 多道移液器 96孔反應(yīng)板 基因工程－－第四章 基因操作過程 ② 雙脫氧法測(cè)序 程序 將待測(cè)基因序列打斷成較短重疊的 DNA片段群 DNA片段連入載體，在，挑取單菌落，分離純化重組載體測(cè)序 加入 DNA聚合酶，dNTP以及帶有熒光標(biāo)記的雙脫氧核苷酸 ddNTP 凝膠電泳，檢測(cè)標(biāo)記過的核苷酸片段的熒光信號(hào)。根據(jù)重疊序列，通過軟件處理，DNA序列信息 基因工程－－第四章 基因操作過程 測(cè)序載體 pUC： 雙鏈質(zhì)粒載體，衍生的載體很多，不同商業(yè)公司有所不同，但基本均由 pUC衍生而來，使用時(shí)需先變性 M13系列和 pUC系列的測(cè)序載體的使用避免了使用物理方法分離大量的 DNA M13： 單鏈?zhǔn)删w載體，目前很少采用 基因工程－－第四章 基因操作過程 測(cè)序 DNA聚合酶 ① DNA聚合酶 Ⅰ Klenow片段 5′→3′ 的聚合酶活性， 3′→5′ 的外切酶活性 持續(xù)合成能力不強(qiáng)，不能復(fù)制富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板區(qū) 以 ddNTP為底物的能力遠(yuǎn)比在 dNTP低 易受 DNA制備時(shí)經(jīng)常產(chǎn)生的污染物的影響，且只對(duì)單鏈模板有效 基因工程－－第四章 基因操作過程 ② T7噬菌體聚合酶 (測(cè)序酶 ) 是一種經(jīng)過修飾的 T7噬菌體 DNA聚合酶，缺乏 3′→5′ 外切酶活性 能產(chǎn)生出非常漂亮的 DNA梯帶，每條帶都具有相似的強(qiáng)度，可讀的 DNA序列可覆蓋凝膠的全長(zhǎng) 測(cè)序酶催化 ddNTP結(jié)合的速率是 dNTP的 33% 具有 ， ，能對(duì)折疊成二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板起作用 測(cè)序酶 526位氨基酸為 Tyr，若換成 Phe，結(jié)合 ddNTP的能力下降 2022倍，將 Ⅰ 或 TaqdnaPol類似氨基酸換面 Tyr其結(jié)合 ddNTP的能力提高 8000倍 基因工程－－第四章 基因操作過程 ③ TaqDNA聚合酶 它在高溫下（ 70℃ ）進(jìn)行終止鏈反應(yīng)的能力可減少測(cè)序反應(yīng)中由于模板 DNA上引物假結(jié)合位點(diǎn)與引物退火錯(cuò)配產(chǎn)生的相關(guān)問題 在測(cè)序凝膠的放射自顯影片上條帶間的強(qiáng)度不同，從頂部到底部條帶逐漸減弱，出現(xiàn)陰影。 可用于富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板 催化 ddNTP結(jié)合的與該區(qū)模板 DNA序列的影響 TaqDNAPol和 PfuPol催化 ddNTP結(jié)合的速率比結(jié)合 dNTP的速率低兩個(gè)數(shù)量級(jí) 基因工程－－第四章 基因操作過程 通用引物的使用避免了合成不同引物的麻煩 （ M13正反向， T7， SP6等） M13 Primers（ TaKaRa 公司） M13 Primer各引物位置圖 基因工程－－第四章 基因操作過程 堿基序列： 5′CATAC GATTT AGGTG ACACT ATAG3′ SP6 Promoter Primer 形態(tài) 凍結(jié)干燥品。可用滅菌水或 TE Buffer (pH ～ ) 溶解后使用 用途 作為具有 SP6 Promoter載體的測(cè)序用引物或 PCR用引物 基因工程－－第四章 基因操作過程 化學(xué)法測(cè)序 (MaxamGilbert procedure) 經(jīng) 凝膠電泳 按大小分離和放射自顯影后，根據(jù) X光片所顯現(xiàn)的相應(yīng)條帶，直接讀出待