【文章內(nèi)容簡介】 　　聯(lián)合疫苗中每一種組分均應(yīng)達(dá)到該組分的純度要求，如Hib－DTP偶聯(lián)疫苗中的Hib組分，即使與已知含有內(nèi)毒素的DTP配制成聯(lián)合疫苗，也應(yīng)當(dāng)符合Hib制品熱原試驗(yàn)的要求。在此種情況下則不要求對成品進(jìn)行熱原檢查。此外，對組分進(jìn)行純度測定用的SDSPAGE檢測，也不適用于成品?！　∷摹⒙?lián)合疫苗臨床研究中應(yīng)注意的問題　　聯(lián)合疫苗的臨床研究與其他疫苗一樣首先應(yīng)遵循《藥品臨床試驗(yàn)管理規(guī)范》（GCP）的要求。由于聯(lián)合疫苗是多組分的，在臨床研究中對于安全性和有效性的研究與單一成分的疫苗有所不同，應(yīng)注意以下幾方面的問題?！　。ㄒ唬┌踩匝芯俊　∫话銇碇v，聯(lián)合疫苗的安全性研究是與同時(shí)在不同部位接種聯(lián)合疫苗中的每一種單價(jià)組分疫苗進(jìn)行比較，例如，接種DTPHB疫苗與分別接種DTP和HB疫苗進(jìn)行比較。臨床試驗(yàn)應(yīng)是隨機(jī)的，且應(yīng)設(shè)對照組，如分別在不同部位同時(shí)注射聯(lián)合疫苗中所含有的單價(jià)組份疫苗的對照?！　∨R床試驗(yàn)中應(yīng)觀察接種后的不良反應(yīng)，還應(yīng)進(jìn)行跟蹤研究，應(yīng)在臨床研究開始前確定不良反應(yīng)的判定標(biāo)準(zhǔn)和跟蹤研究方案。一般滅活疫苗應(yīng)進(jìn)行7天的主動監(jiān)測，活疫苗應(yīng)進(jìn)行14天以上的主動監(jiān)測，還應(yīng)進(jìn)行30 天電話隨訪或采用調(diào)查表的方式。觀察的不良反應(yīng)包括全身反應(yīng)如：發(fā)熱、不適、頭疼、嘔吐、哭鬧，及紅斑、硬結(jié)、疼痛、 觸痛等局部反應(yīng)；以及不常見或罕見的不良反應(yīng)?！　。ǘ┟庖咴匝芯俊　?yīng)當(dāng)對聯(lián)合疫苗中所有組分的免疫原性進(jìn)行研究。應(yīng)當(dāng)將聯(lián)合疫苗的免疫原性與分別同時(shí)接種在不同部位的各單價(jià)組分疫苗的免疫原性進(jìn)行比較，如果聯(lián)合疫苗中的某些組分是已獲生產(chǎn)文號的，那么，該已獲得文號的單組份疫苗可以用于免疫原性研究的對照組。聯(lián)合疫苗中的每一種血清型或組分在聯(lián)合疫苗中均應(yīng)有相應(yīng)的免疫原性要求。在臨床試驗(yàn)方案中應(yīng)包含各組分免疫原性與其保護(hù)性之間關(guān)系研究的要求。　　評價(jià)每一組分的免疫原性的參數(shù)是非常關(guān)鍵的，應(yīng)廣泛征求有關(guān)專家的意見，確定評價(jià)疫苗免疫原性的參數(shù)以及各參數(shù)的合格標(biāo)準(zhǔn)。一般來講，抗體水平和血清陽轉(zhuǎn)對于臨床保護(hù)性只起一定的參考作用。應(yīng)當(dāng)注重抗體的質(zhì)量而不是僅僅是抗體的量，例如，抗體的親和性、功能、抗原決定族的識別位點(diǎn)以及其他規(guī)定的參數(shù)對確定應(yīng)答抗體的質(zhì)量是非常重要的?！　∶庖咴员容^研究的目的旨在證明聯(lián)合疫苗接種后各組份疫苗的免疫應(yīng)答與同時(shí)分別接種聯(lián)合疫苗中的各單組份疫苗后的免疫應(yīng)答之間是否有顯著區(qū)別。研究的設(shè)計(jì)應(yīng)能證明聯(lián)合疫苗與原單價(jià)疫苗的免疫原性相一致，應(yīng)能證明和排除在臨床上抗體幾何平均滴度（GMTs）和/或者血清陽轉(zhuǎn)率方面的顯著性差別，同時(shí)應(yīng)考慮測定方法和受試者的內(nèi)在變化的影響。臨床試驗(yàn)方案中應(yīng)對聯(lián)合疫苗接種后各單組份疫苗的免疫應(yīng)答與直接接種單組份疫苗的免疫應(yīng)答可能存在的顯著差別作出明確的定義，在試驗(yàn)假設(shè)中應(yīng)清楚地表明哪些差別是將被排除的，并且以此來計(jì)算出受試人群的大小。應(yīng)當(dāng)對任何觀測到的差別評價(jià)其臨床相關(guān)性，對每一個(gè)組分在免疫劑量或免疫程序上的改變，均應(yīng)有臨床數(shù)據(jù)作為其改變的依據(jù)?！　∮糜谂R床驗(yàn)證的制品批數(shù)可以比用于生產(chǎn)一致性研究的批數(shù)少。但是，在某些情況下，例如制品中含有未獲生產(chǎn)文號的組分時(shí)，臨床驗(yàn)證時(shí)應(yīng)使用更多的批數(shù)，應(yīng)至少有一批是用于生產(chǎn)一致性研究的制品，并且，應(yīng)采用制備聯(lián)合疫苗的同批單價(jià)疫苗進(jìn)行接種的對照組試驗(yàn)，以避免由于批間的不同而引起免疫原性的不同。對所使用的疫苗批間的差異要進(jìn)行分析。因此，臨床試驗(yàn)也應(yīng)考慮以上因素對臨床研究結(jié)果的影響?！　。ㄈ┯行匝芯俊　∶恳唤M分的有效性均應(yīng)經(jīng)過臨床試驗(yàn)得到證明。比較理想的臨床試驗(yàn)是前瞻性的、隨機(jī)的和有對照的。評價(jià)有效性所使用的判定終點(diǎn)，一般是疾病的發(fā)病率，但也可以是已經(jīng)確定了的“保護(hù)性相關(guān)指標(biāo)”。疫苗有效性試驗(yàn)中所使用的保護(hù)性相關(guān)指標(biāo)，應(yīng)為經(jīng)過充分驗(yàn)證的和臨床試驗(yàn)證明的可以保護(hù)該疾病的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)。如果一個(gè)免疫學(xué)的保護(hù)性相關(guān)指標(biāo)在能夠確定質(zhì)和量的相互關(guān)系時(shí)，就可以代替流行病學(xué)指標(biāo)。具有一定滴度的某些類別的抗體與保護(hù)性具有相關(guān)性，則認(rèn)為可保護(hù)受試者免于破傷風(fēng)的發(fā)生?！　∪绻?lián)合疫苗中的單組分疫苗的保護(hù)性效力是經(jīng)過證實(shí)的，這一研究結(jié)果可以作為參考資料來支持聯(lián)合疫苗的研發(fā)。在臨床試驗(yàn)時(shí)，可采用與單價(jià)組份疫苗的橋接試驗(yàn)來比較聯(lián)合疫苗中這組份疫苗的保護(hù)性效力。　　如果聯(lián)合疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體水平低于單價(jià)組分疫苗，但仍能達(dá)到保護(hù)性作用的，應(yīng)提供相應(yīng)的數(shù)據(jù)或資料證明其保護(hù)的有效性及持久性?！　≡谠u價(jià)制品有效性時(shí)，一般不選用病例對照試驗(yàn)（casecontrol）。由于該試驗(yàn)在許多方面有可能產(chǎn)生偏差，因此，在采用該方法時(shí)，應(yīng)在試驗(yàn)方案中詳盡地闡述如何降低偏差和采取的糾正措施?！　∫话銇碚f，測定多價(jià)血清型的聯(lián)合疫苗中每一個(gè)血清型的效力是比較困難的。因此可采用相應(yīng)的替代方案。應(yīng)當(dāng)根據(jù)目標(biāo)人群中相應(yīng)血清型疾病的發(fā)病率設(shè)計(jì)此類疫苗有效性的臨床試驗(yàn)。如果臨床試驗(yàn)的判定終點(diǎn)是以該疫苗所預(yù)防的各型疾病發(fā)病率的總和時(shí)，該試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)具有相當(dāng)?shù)囊?guī)模，即確保發(fā)病率低的血清型仍能有一定數(shù)量人群的數(shù)據(jù)，以評價(jià)其有效性?！　τ诙鄡r(jià)血清型的聯(lián)合疫苗，由于缺乏足夠數(shù)量的病例而不能夠進(jìn)行臨床有效性的評價(jià)時(shí)，在某些情況下，可以用免疫原性的數(shù)據(jù)推斷其有效性。如果在臨床上已經(jīng)證明了血清學(xué)和有效性存在著相關(guān)關(guān)系時(shí)，可以使用免疫原性數(shù)據(jù)推斷其有效性?！　。ㄋ模?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)　　臨床研究中很重要的一個(gè)問題是確定受試人群的大小?，F(xiàn)在尚無計(jì)算聯(lián)合疫苗臨床試驗(yàn)受試人群大小的標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)主要基于統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床學(xué)和基礎(chǔ)科學(xué)的評價(jià)結(jié)果。　　多數(shù)聯(lián)合疫苗的臨床試驗(yàn)均以在不同部位分別接種各組分疫苗或接種各組份混合后疫苗為試驗(yàn)的對照組，受試者應(yīng)當(dāng)隨機(jī)地分配到各疫苗組。按照受試者的特性（如：年齡或者到達(dá)試驗(yàn)點(diǎn)的日期）分組的方法不符合隨機(jī)分配的原則?！　榱俗C明聯(lián)合疫苗與單價(jià)疫苗等效性的臨床試驗(yàn)，應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)一個(gè)拒絕有區(qū)別的假設(shè)試驗(yàn)，而不是傳統(tǒng)意義上的無區(qū)別的“無效”假設(shè)試驗(yàn)。為了證明發(fā)生率和比例相同或等價(jià)時(shí)，采用單側(cè)檢驗(yàn)是適宜的，因臨床試驗(yàn)的目的在于證明注射聯(lián)合疫苗與分別注射的單價(jià)組分疫苗無明顯差異?！　∪绻C明聯(lián)合疫苗優(yōu)于分別注射的單價(jià)組分疫苗，應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)一個(gè)檢驗(yàn)差異的臨床試驗(yàn)，而不是一個(gè)檢驗(yàn)等價(jià)的試驗(yàn)?！　τ诿庖邞?yīng)答，一般分析接種后的GMT或GMR（應(yīng)答率的幾何均值），通常是為了排除聯(lián)合疫苗和分別注射的單價(jià)組分疫苗間在臨床上有意義的差別。對于要排除事先規(guī)定的差別的臨床試驗(yàn)規(guī)模，應(yīng)計(jì)算考慮受試人群的大小?！　∪绻?lián)合疫苗的免疫應(yīng)答未顯示明顯地低于分別注射的單價(jià)疫苗，那么，可采用雙側(cè)的生物等價(jià)檢驗(yàn)來分析GMT。理想的設(shè)計(jì)是聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)所產(chǎn)生的抗體滴度既不比預(yù)先規(guī)定的量太低也不會太高。　　臨床結(jié)果分析時(shí)，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行血清的陽轉(zhuǎn)率與抗體滴度的分析比較研究。在沒有保護(hù)性替代指標(biāo)的情況下，如果沒有陽轉(zhuǎn)率與GMT間的分析和評價(jià)是很難得出結(jié)論。如果已經(jīng)建立了保護(hù)性免疫的替代指標(biāo)，在評價(jià)聯(lián)合疫苗和分別注射的單價(jià)組分疫苗間的差別時(shí)，就應(yīng)當(dāng)考慮保護(hù)性免疫替代指標(biāo)。　　對于評價(jià)常見的不良反應(yīng)，試驗(yàn)組中聯(lián)合疫苗為一個(gè)接種部位，而對照組為二個(gè)或多個(gè)接種部位，這種對比分析試驗(yàn)不是雙盲的。因此，在分析時(shí)應(yīng)將單部位接種的反應(yīng)（聯(lián)合疫苗組）與多部位接種（對照組）當(dāng)中反應(yīng)最嚴(yán)重的一點(diǎn)進(jìn)行比較。還應(yīng)考慮到在個(gè)體內(nèi)的不同組分間的相互作用。　　對于不常見的不良反應(yīng)的評價(jià)，臨床試驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)疫苗目標(biāo)人群的大小來確定受試人群的大小。　　對于罕見的不良反應(yīng)的評價(jià)，受試人群的規(guī)模應(yīng)當(dāng)足夠大，如果未觀察到不良反應(yīng)，可認(rèn)為在目標(biāo)人群中發(fā)生的可能性也很低。　　總之，聯(lián)合疫苗的研發(fā)和臨床試驗(yàn)不同于一般疫苗，除一般要求以外，還應(yīng)充分考慮多種組分聯(lián)合后產(chǎn)生的相互作用對聯(lián)合后疫苗的安全性和有效性的影響，以及是否產(chǎn)生毒性逆轉(zhuǎn)或重組。在臨床試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用聯(lián)合疫苗中各組分分別但同時(shí)接種作為對照組，由于對照組是多部位接種，給不良反應(yīng)的評價(jià)帶來了困難，同時(shí)還應(yīng)充分考慮各組分在體內(nèi)的相互作用而產(chǎn)生的影響。因此，不能簡單地采用一種固定的模式研究聯(lián)合疫苗的安全性和有效性。多肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導(dǎo)原則 　　　　　　　　　　　　　　　　　　前　　言　　多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預(yù)測的某段抗原表位的氨基酸序列，通過化學(xué)合成技術(shù)制備的疫苗。傳統(tǒng)疫苗一般由兩種方式制備，一種為能誘發(fā)免疫力卻不致病的減毒疫苗，例如黃熱病、脊髓灰質(zhì)炎和麻疹疫苗或卡介苗；另一種為滅活疫苗（例如百日咳桿菌、狂犬病毒、傷寒桿菌）。多肽疫苗由于完全是合成的，不存在毒力回升或滅活不全的問題。特別是一些還不能通過體外培養(yǎng)方式獲得足夠量的抗原的微生物病原體。有些雖能進(jìn)行體外培養(yǎng)，但這些病原體有潛在致病性和免疫病理作用等涉及安全性與有效性的問題。多肽作為體內(nèi)引起效應(yīng)細(xì)胞免疫應(yīng)答形成的免疫原，將成為一種新型的疫苗，但還有很多理論和技術(shù)問題要繼續(xù)研究，目前尚無多肽疫苗獲準(zhǔn)上市。因此，應(yīng)采取適當(dāng)可行的途徑對這種潛能疫苗進(jìn)行生產(chǎn)及質(zhì)控，并在其生產(chǎn)過程中積累經(jīng)驗(yàn)，為此，應(yīng)加強(qiáng)咨詢和論證，以便提出一個(gè)確保安全有效而又適合實(shí)際的申報(bào)資料。同時(shí)，對每個(gè)方案中各個(gè)階段的操作過程、中間及最終產(chǎn)品的制備，務(wù)必制定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，并予嚴(yán)格實(shí)施?！　∫弧⒍嚯囊呙绲幕瘜W(xué)合成　　首先應(yīng)該確定天然抗原的氨基酸序列，選擇和確定尋找有效肽段的方法，并尋找該肽段所針對的抗原決定簇?！　∑浯螒?yīng)選擇合適的合成方法。合成中等大小的多肽也會涉及眾多反應(yīng)，每加入一個(gè)氨基酸需多次反應(yīng)，在一個(gè)氨基酸的α氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基縮合形成肽鏈之前，必須使其中一個(gè)形成高反應(yīng)的活化狀態(tài)，這個(gè)選擇自然落到羧基上，合成因而從C到N端。如果A氨基酸的C端與B氨基酸的N端縮合產(chǎn)生2肽A－B，則A的N端及B的C端必須保護(hù)起來，才能轉(zhuǎn)化成在A－B之間形成特異性肽的形式。此外，氨基肽的側(cè)鏈基團(tuán)也能與活化羧基反應(yīng)，因此也必須保護(hù)起來。這些側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)必須能耐受除去α－氨基保護(hù)基團(tuán)的條件，這樣才能生成新的氨基基團(tuán)使肽鏈得以繼續(xù)延長。合成結(jié)束后必須除去所有的保護(hù)性基團(tuán)以得到所需的多肽。多肽的合成循環(huán)包括了一系列的反應(yīng)，每一循環(huán)生成一個(gè)新肽鍵?！　≈饕袃蓚€(gè)合成策略：片段濃縮法和固相合成法（merrifield法）。片段濃縮法是經(jīng)典的合成技術(shù)。首先合成數(shù)條小肽，經(jīng)純化和去保護(hù)后結(jié)合成較長的肽，直到最后所需的序列?！　≡诠滔嗪铣煞ㄊ菍㈦逆溡欢私Y(jié)合于固相載體上的方法。通過在N－末端逐步加上氨基酸的方法合成肽段?！　×硗庖惨胍恍┬逻M(jìn)展包括改良的保護(hù)基因、新的固相載體、脫保護(hù)及側(cè)鏈功基保護(hù)等新方法。在疫苗合成領(lǐng)域中，由于肽鏈聯(lián)接或裝配到需要的結(jié)構(gòu)（TADPs）及免疫原性構(gòu)架（MAPs）所用技術(shù)的引進(jìn)，加上肽鏈經(jīng)脂質(zhì)或碳水化合物的修飾作用，使得合成問題變得更加復(fù)雜。目前多應(yīng)用固相法，特別是在選擇和確定有效抗原表位研究方面，是合成多肽疫苗的一條可供選擇的途徑?！　《⒍嚯囊呙绲纳a(chǎn)工藝及質(zhì)控　?。ㄒ唬?yīng)提供研制某一疫苗的詳細(xì)資料，包括選擇特定抗原決定簇的理由、對抗原決定簇的檢定，以及對載體、表位連接、結(jié)合劑、肽的呈遞方式及佐劑等的選擇理由及其相應(yīng)證據(jù)?！　。ǘ?yīng)說明每條肽段所針對的抗原表位。內(nèi)容包括對每個(gè)表位來源的說明，當(dāng)不止一個(gè)表位時(shí)，應(yīng)說明把不同表位相互結(jié)合到一個(gè)已知序列內(nèi)的理由，此外還應(yīng)對表位的類型（B、Th、Tc等）及特殊組合方式進(jìn)行說明?！　。ㄈ?yīng)當(dāng)提供肽鏈合成的詳細(xì)資料。內(nèi)容包括：原料的來源和特性、使用的方法學(xué)、氨基酸的連接和脫保護(hù)，進(jìn)入下一步連接的判斷標(biāo)準(zhǔn)，任何加入的修飾基團(tuán)（例如糖基化，脂質(zhì)化）的詳細(xì)情況。如果采用了液體合成法，應(yīng)當(dāng)提供包括對中間體有特殊說明的流程圖?！　。ㄋ模┤绻膯误w為中間產(chǎn)物，應(yīng)當(dāng)對其分離鑒定并提供下述確證依據(jù)。　　1．主要肽順序與預(yù)期的結(jié)構(gòu)相同，例如，目標(biāo)氨基酸按需要的順序排列；修飾（脂化及糖基化）情況；　　2．對肽單體中的主要雜質(zhì)（可能情況下對次要雜質(zhì)）應(yīng)分離鑒定。驗(yàn)證純度時(shí)應(yīng)采用多種技術(shù)對其理化特性盡可能多地檢查，特別要注意檢測生產(chǎn)或純化過程中可能加入的物質(zhì)；　　3．連續(xù)多批產(chǎn)品的肽質(zhì)量應(yīng)保持一致?！　。ㄎ澹﹄膯误w或肽衍生物應(yīng)建立適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)。對肽的純度、總雜質(zhì)、每種主要及次要雜質(zhì)都應(yīng)規(guī)定限度要求?！　。┤绻荒軐﹄膯误w進(jìn)行全面鑒定，應(yīng)提供相應(yīng)說明?！　。ㄆ撸?yīng)對肽的穩(wěn)定性進(jìn)行評價(jià)，并制定適當(dāng)?shù)馁A存期?！　。ò耍┡悸?lián)物偶聯(lián)物中多肽及其它成分除了達(dá)到適當(dāng)?shù)囊笸?，還應(yīng)符合下列規(guī)定：　　1．對偶聯(lián)物進(jìn)行驗(yàn)證，其含量應(yīng)能重復(fù)并保持一致，當(dāng)不止一種肽結(jié)合到同一載體上時(shí)，應(yīng)對每一種肽所占比例進(jìn)行控制并能重復(fù)制備；　　2．最大限度降低副反應(yīng)并控制到能重復(fù)的水平，這些副反應(yīng)包括載體之間的交聯(lián)，載體表面濃縮的未結(jié)合的偶聯(lián)劑，以及對未參與結(jié)合的偶聯(lián)劑的滅活等；　　3．有證據(jù)表明偶聯(lián)物未改變抗原序列；　　4．應(yīng)當(dāng)考慮機(jī)體對載體蛋白或其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的潛在臨床影響；　　5．當(dāng)同一載體用于幾種疫苗或一種疫苗的幾種不同表位時(shí)，應(yīng)考慮特異性表位抑制的可能性，并進(jìn)行調(diào)查；　　6．應(yīng)當(dāng)最大限度地降低殘余溶劑或副產(chǎn)品的含量，并設(shè)定相應(yīng)限定要求；　　7．應(yīng)當(dāng)設(shè)定適宜的可接受的標(biāo)準(zhǔn)，合適的參考制品可能是必要的?！　。ň牛┹d體　　肽可以聯(lián)接或結(jié)合到載體上，選擇載體時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎，因?yàn)閷d體的免疫應(yīng)答可能會掩蔽對肽的免疫應(yīng)答。目標(biāo)人群中的一部分可能對某一載體存在過敏反應(yīng)或某些載體有刺激自身免疫的危險(xiǎn)，應(yīng)避免選擇這些載體。載體應(yīng)有自已的檔案材料及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，它包括：載體的鑒定，生產(chǎn)一致性的證據(jù)，蛋白質(zhì)的安全性以及與蛋白質(zhì)、脂多糖、多聚體、脂質(zhì)體等相關(guān)的一些特征試驗(yàn)。例如，聚合體和脂多糖應(yīng)當(dāng)具有可重復(fù)的分子量范圍，脂多糖具有一致的單糖組分，脂質(zhì)體具有一致的結(jié)構(gòu)、組分。對不同成分及雜質(zhì)應(yīng)鑒別定性并加以定量測定，對于生物來源的載體應(yīng)當(dāng)采取措施，確保檢測不出感染因子?！　。ㄊ┚酆稀⑼榛蜉d體合成肽　　無論是與聚合肽構(gòu)架（例如MAP）結(jié)合的肽，或肽單體合成后再進(jìn)一步形