【正文】 II───────────────────────────────────────　　（二）生產(chǎn)過(guò)程變更均應(yīng)進(jìn)行相關(guān)的技術(shù)評(píng)價(jià)，并應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證?！　?．培養(yǎng)基主要成份　　　 * 變更前、后的培養(yǎng)基成份改變情況、檢測(cè)方法及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢定報(bào)告；　　　 * 培養(yǎng)基成份改變對(duì)產(chǎn)品有效成分生物學(xué)影響的技術(shù)數(shù)據(jù)和驗(yàn)證資料；　　　 * 非BSE牛源地的證明材料?！　?．生產(chǎn)工藝部分變更，如增加、減少分離步驟或由精制改為柱層析 　　　 * 變更原因說(shuō)明；　　　 * 工藝驗(yàn)證資料；　　　 * 連續(xù)3批產(chǎn)品質(zhì)量分析資料，包括生產(chǎn)各關(guān)鍵階段中間品及終產(chǎn)品的分析、生物學(xué)檢測(cè)；　　　 * 兩種工藝條件下產(chǎn)品主要有效成分生物有效性和質(zhì)量的比較及穩(wěn)定性研究；　　　 * 應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)工藝變更的具體情況，進(jìn)行必要的安全、有效性研究，必要時(shí)進(jìn)行臨床試驗(yàn)?！　?．培養(yǎng)時(shí)間改變　　　 * 變更原因說(shuō)明；　　　 * 培養(yǎng)時(shí)間的優(yōu)化研究資料；　　　 * 變更前、后主要有效成分生物學(xué)變化的研究；　　　 * 連續(xù)3批產(chǎn)品質(zhì)量分析資料，包括生產(chǎn)各關(guān)鍵階段中間產(chǎn)品、原液及終產(chǎn)品的分析、檢測(cè)及穩(wěn)定性研究資料；　　　 * 根據(jù)情況進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐R床試驗(yàn)。　　8．緩沖液、參數(shù)改變；　　　 * 變更原因及變更前后緩沖液組成對(duì)比；　　　 * 變更前后主要有效成分生物學(xué)變化數(shù)據(jù)資料；　　　 * 連續(xù)3批產(chǎn)品質(zhì)量分析資料，包括生產(chǎn)各關(guān)鍵階段中間品及終產(chǎn)品的分析、生物學(xué)檢測(cè)及穩(wěn)定性研究資料；　　　 * 應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐R床試驗(yàn)?！　?0．主要生產(chǎn)設(shè)備的變更（如消毒、凍干、分裝、發(fā)酵罐、血液制品生產(chǎn)用離心機(jī)、壓濾機(jī)）　　　 * 變更原因說(shuō)明；　　　 * 變更后的設(shè)備和工藝驗(yàn)證資料；　　　 * 變更前、后主要技術(shù)參數(shù)的對(duì)比，及變更后的關(guān)鍵指標(biāo)檢測(cè)；　　　 * 變更前、后連續(xù)3批產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量分析資料；　　　 * 必要時(shí)進(jìn)行穩(wěn)定性研究；　　11．防腐劑、佐劑、輔料；　　　 * 變更原因說(shuō)明；　　　 * 變更后防腐劑、佐劑、輔料的配制方法及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；　　　 * 變更前、后產(chǎn)品主要有效成分生物有效性的對(duì)比研究資料；　　　 * 變更后產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；　　　 * 穩(wěn)定性研究；　　　 * 必要時(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐R床試驗(yàn)。如果將載體疫苗和偶聯(lián)疫苗的載體菌或偶聯(lián)的載體成分所引起的疾病也作為其適應(yīng)癥時(shí)，則載體疫苗和偶聯(lián)疫苗也屬于聯(lián)合疫苗。論及的內(nèi)容不可能面面俱到，在實(shí)際應(yīng)用中可能會(huì)遇到許多技術(shù)問(wèn)題，對(duì)于特定問(wèn)題和特定的制品，應(yīng)視具體問(wèn)題具體研究決定?！　∫?、聯(lián)合疫苗研究開(kāi)發(fā)中應(yīng)考慮的問(wèn)題　　聯(lián)合疫苗的研發(fā)過(guò)程中，應(yīng)對(duì)聯(lián)合后疫苗各組分間的相互作用，以及防腐劑、佐劑和非活性成分等對(duì)聯(lián)合后活性成分的影響等進(jìn)行研究?！　。ㄒ唬┙M分間的相容性　　以往的經(jīng)驗(yàn)表明，單價(jià)疫苗在聯(lián)合后會(huì)使疫苗的安全和效力發(fā)生改變。因此，在開(kāi)展臨床試驗(yàn)前，應(yīng)對(duì)聯(lián)合疫苗中各組分間的相容性進(jìn)行驗(yàn)證。為了進(jìn)一步證明組分間的相容性，在臨床前的研究中，應(yīng)采用適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型，確定聯(lián)合后對(duì)各組分的效力和免疫原性是否有影響。因此，應(yīng)當(dāng)測(cè)定組分在單價(jià)時(shí)和聯(lián)合時(shí)是否有恢復(fù)變異的趨勢(shì)?！　。ǘ┓栏瘎?duì)聯(lián)合疫苗的影響　　防腐劑或穩(wěn)定劑有可能改變疫苗的效力，如DTPIPV中的硫柳汞可抑制IPV的效力；應(yīng)考慮防腐劑對(duì)組分毒性逆轉(zhuǎn)的影響，還應(yīng)考慮定量測(cè)定各成分或抗微生物物質(zhì)的殘余量，以及進(jìn)行防腐劑對(duì)成品抗污染能力的研究。對(duì)于未被吸附（游離）的組分在配制后吸附情況，例如未被吸附的組分是否會(huì)被吸附；已吸附的組分是否會(huì)被解離下來(lái)，即研究存放時(shí)間對(duì)佐劑吸附抗原的影響等?！　。ㄋ模┓腔钚猿煞謱?duì)聯(lián)合疫苗的影響　　在配方的開(kāi)發(fā)階段，應(yīng)當(dāng)測(cè)定不同的緩沖液、鹽類、穩(wěn)定劑（比如乳糖、明膠、山梨醇等）以及其他化學(xué)因素是否對(duì)疫苗的安全性、純度或效力產(chǎn)生有害的相互作用。由于疫苗的有效期是從成品的效力試驗(yàn)開(kāi)始計(jì)算的，所以還應(yīng)考慮以下三個(gè)方面對(duì)疫苗有效期的影響，即生產(chǎn)過(guò)程中和配制前每一組分的保存時(shí)間、效力試驗(yàn)開(kāi)始前后的聯(lián)合疫苗的保存時(shí)間。按有效期最短的組分確定聯(lián)合疫苗的有效期，即應(yīng)綜合考慮各組分的有效期。　　二、聯(lián)合疫苗生產(chǎn)中應(yīng)考慮的問(wèn)題　　生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)考慮的主要問(wèn)題是生產(chǎn)的一致性，即生產(chǎn)的穩(wěn)定性，應(yīng)證明在已確定的生產(chǎn)條件下生產(chǎn)出的產(chǎn)品是穩(wěn)定和一致的?！　。ǘ﹩蝺r(jià)組分混合時(shí)應(yīng)考慮的問(wèn)題　　在配制聯(lián)合疫苗時(shí)每一種抗原應(yīng)至少使用三批，但對(duì)已獲生產(chǎn)文號(hào)的抗原（單價(jià)疫苗）可少于三批，沒(méi)有必要對(duì)聯(lián)合疫苗中所有組分的連續(xù)批進(jìn)行聯(lián)合配比的測(cè)定，但應(yīng)當(dāng)證明疫苗中每一抗原組分的生產(chǎn)一致性。采用這種方式配制可減少成品的批數(shù)。如果目前尚無(wú)令人滿意的聯(lián)合疫苗檢測(cè)方法，應(yīng)盡快開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)方法，以測(cè)定每一種組分的含量或效價(jià)。如果不能達(dá)到規(guī)程要求時(shí)，應(yīng)證明其效價(jià)降低是由于聯(lián)合疫苗中組分間的相互作用所致，并證明降低的效價(jià)不會(huì)導(dǎo)致人群免疫后低的免疫應(yīng)答。對(duì)含有佐劑的疫苗，抗原的吸附度對(duì)制品的效價(jià)會(huì)產(chǎn)生較大的影響，因此應(yīng)測(cè)定成品的效力。效力試驗(yàn)可以用動(dòng)物免疫原性試驗(yàn)，對(duì)每一種抗原的免疫應(yīng)答以及應(yīng)答的質(zhì)量都應(yīng)進(jìn)行研究，這些研究應(yīng)當(dāng)包括測(cè)定抗體的分類、親和力、親和性、抗體動(dòng)態(tài)變化或功能，例如測(cè)定中和靶抗原或毒素的能力。同樣，也應(yīng)在動(dòng)物免疫原性研究中測(cè)定活疫苗株之間的免疫干擾現(xiàn)象。保護(hù)力試驗(yàn)應(yīng)當(dāng)采用擬預(yù)防疾病的有毒株來(lái)攻擊。此項(xiàng)試驗(yàn)應(yīng)在產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)早期進(jìn)行。　?。ㄋ模o(wú)菌檢查　　聯(lián)合疫苗中的各組份以及成品疫苗均應(yīng)符合無(wú)菌試驗(yàn)的要求?！　。ㄎ澹┘兌仍囼?yàn)　　聯(lián)合疫苗中每一種組分均應(yīng)達(dá)到該組分的純度要求，如Hib－DTP偶聯(lián)疫苗中的Hib組分，即使與已知含有內(nèi)毒素的DTP配制成聯(lián)合疫苗，也應(yīng)當(dāng)符合Hib制品熱原試驗(yàn)的要求。此外，對(duì)組分進(jìn)行純度測(cè)定用的SDSPAGE檢測(cè)，也不適用于成品。由于聯(lián)合疫苗是多組分的，在臨床研究中對(duì)于安全性和有效性的研究與單一成分的疫苗有所不同，應(yīng)注意以下幾方面的問(wèn)題。臨床試驗(yàn)應(yīng)是隨機(jī)的，且應(yīng)設(shè)對(duì)照組，如分別在不同部位同時(shí)注射聯(lián)合疫苗中所含有的單價(jià)組份疫苗的對(duì)照。一般滅活疫苗應(yīng)進(jìn)行7天的主動(dòng)監(jiān)測(cè)，活疫苗應(yīng)進(jìn)行14天以上的主動(dòng)監(jiān)測(cè)，還應(yīng)進(jìn)行30 天電話隨訪或采用調(diào)查表的方式?！　。ǘ┟庖咴匝芯俊　?yīng)當(dāng)對(duì)聯(lián)合疫苗中所有組分的免疫原性進(jìn)行研究。聯(lián)合疫苗中的每一種血清型或組分在聯(lián)合疫苗中均應(yīng)有相應(yīng)的免疫原性要求?！　≡u(píng)價(jià)每一組分的免疫原性的參數(shù)是非常關(guān)鍵的，應(yīng)廣泛征求有關(guān)專家的意見(jiàn)，確定評(píng)價(jià)疫苗免疫原性的參數(shù)以及各參數(shù)的合格標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)當(dāng)注重抗體的質(zhì)量而不是僅僅是抗體的量，例如，抗體的親和性、功能、抗原決定族的識(shí)別位點(diǎn)以及其他規(guī)定的參數(shù)對(duì)確定應(yīng)答抗體的質(zhì)量是非常重要的。研究的設(shè)計(jì)應(yīng)能證明聯(lián)合疫苗與原單價(jià)疫苗的免疫原性相一致，應(yīng)能證明和排除在臨床上抗體幾何平均滴度（GMTs）和/或者血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率方面的顯著性差別，同時(shí)應(yīng)考慮測(cè)定方法和受試者的內(nèi)在變化的影響。應(yīng)當(dāng)對(duì)任何觀測(cè)到的差別評(píng)價(jià)其臨床相關(guān)性，對(duì)每一個(gè)組分在免疫劑量或免疫程序上的改變，均應(yīng)有臨床數(shù)據(jù)作為其改變的依據(jù)。但是，在某些情況下，例如制品中含有未獲生產(chǎn)文號(hào)的組分時(shí)，臨床驗(yàn)證時(shí)應(yīng)使用更多的批數(shù)，應(yīng)至少有一批是用于生產(chǎn)一致性研究的制品，并且，應(yīng)采用制備聯(lián)合疫苗的同批單價(jià)疫苗進(jìn)行接種的對(duì)照組試驗(yàn)，以避免由于批間的不同而引起免疫原性的不同。因此，臨床試驗(yàn)也應(yīng)考慮以上因素對(duì)臨床研究結(jié)果的影響。比較理想的臨床試驗(yàn)是前瞻性的、隨機(jī)的和有對(duì)照的。疫苗有效性試驗(yàn)中所使用的保護(hù)性相關(guān)指標(biāo)，應(yīng)為經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證的和臨床試驗(yàn)證明的可以保護(hù)該疾病的實(shí)驗(yàn)室參數(shù)。具有一定滴度的某些類別的抗體與保護(hù)性具有相關(guān)性，則認(rèn)為可保護(hù)受試者免于破傷風(fēng)的發(fā)生。在臨床試驗(yàn)時(shí)，可采用與單價(jià)組份疫苗的橋接試驗(yàn)來(lái)比較聯(lián)合疫苗中這組份疫苗的保護(hù)性效力?！　≡谠u(píng)價(jià)制品有效性時(shí)，一般不選用病例對(duì)照試驗(yàn)（casecontrol）?！　∫话銇?lái)說(shuō)，測(cè)定多價(jià)血清型的聯(lián)合疫苗中每一個(gè)血清型的效力是比較困難的。應(yīng)當(dāng)根據(jù)目標(biāo)人群中相應(yīng)血清型疾病的發(fā)病率設(shè)計(jì)此類疫苗有效性的臨床試驗(yàn)?！　?duì)于多價(jià)血清型的聯(lián)合疫苗，由于缺乏足夠數(shù)量的病例而不能夠進(jìn)行臨床有效性的評(píng)價(jià)時(shí)，在某些情況下，可以用免疫原性的數(shù)據(jù)推斷其有效性。　?。ㄋ模?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)　　臨床研究中很重要的一個(gè)問(wèn)題是確定受試人群的大小?！　《鄶?shù)聯(lián)合疫苗的臨床試驗(yàn)均以在不同部位分別接種各組分疫苗或接種各組份混合后疫苗為試驗(yàn)的對(duì)照組，受試者應(yīng)當(dāng)隨機(jī)地分配到各疫苗組?！　榱俗C明聯(lián)合疫苗與單價(jià)疫苗等效性的臨床試驗(yàn)，應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)一個(gè)拒絕有區(qū)別的假設(shè)試驗(yàn)，而不是傳統(tǒng)意義上的無(wú)區(qū)別的“無(wú)效”假設(shè)試驗(yàn)?！　∪绻C明聯(lián)合疫苗優(yōu)于分別注射的單價(jià)組分疫苗，應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)一個(gè)檢驗(yàn)差異的臨床試驗(yàn)，而不是一個(gè)檢驗(yàn)等價(jià)的試驗(yàn)。對(duì)于要排除事先規(guī)定的差別的臨床試驗(yàn)規(guī)模，應(yīng)計(jì)算考慮受試人群的大小。理想的設(shè)計(jì)是聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)所產(chǎn)生的抗體滴度既不比預(yù)先規(guī)定的量太低也不會(huì)太高。在沒(méi)有保護(hù)性替代指標(biāo)的情況下，如果沒(méi)有陽(yáng)轉(zhuǎn)率與GMT間的分析和評(píng)價(jià)是很難得出結(jié)論?！　?duì)于評(píng)價(jià)常見(jiàn)的不良反應(yīng)，試驗(yàn)組中聯(lián)合疫苗為一個(gè)接種部位，而對(duì)照組為二個(gè)或多個(gè)接種部位，這種對(duì)比分析試驗(yàn)不是雙盲的。還應(yīng)考慮到在個(gè)體內(nèi)的不同組分間的相互作用。　　對(duì)于罕見(jiàn)的不良反應(yīng)的評(píng)價(jià)，受試人群的規(guī)模應(yīng)當(dāng)足夠大，如果未觀察到不良反應(yīng)，可認(rèn)為在目標(biāo)人群中發(fā)生的可能性也很低。在臨床試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用聯(lián)合疫苗中各組分分別但同時(shí)接種作為對(duì)照組，由于對(duì)照組是多部位接種，給不良反應(yīng)的評(píng)價(jià)帶來(lái)了困難，同時(shí)還應(yīng)充分考慮各組分在體內(nèi)的相互作用而產(chǎn)生的影響。多肽疫苗生產(chǎn)及質(zhì)控技術(shù)指導(dǎo)原則 　　　　　　　　　　　　　　　　　　前　　言　　多肽疫苗是按照病原體抗原基因中已知或預(yù)測(cè)的某段抗原表位的氨基酸序列，通過(guò)化學(xué)合成技術(shù)制備的疫苗。多肽疫苗由于完全是合成的，不存在毒力回升或滅活不全的問(wèn)題。有些雖能進(jìn)行體外培養(yǎng)，但這些病原體有潛在致病性和免疫病理作用等涉及安全性與有效性的問(wèn)題。因此，應(yīng)采取適當(dāng)可行的途徑對(duì)這種潛能疫苗進(jìn)行生產(chǎn)及質(zhì)控，并在其生產(chǎn)過(guò)程中積累經(jīng)驗(yàn)，為此，應(yīng)加強(qiáng)咨詢和論證，以便提出一個(gè)確保安全有效而又適合實(shí)際的申報(bào)資料。　　一、多肽疫苗的化學(xué)合成　　首先應(yīng)該確定天然抗原的氨基酸序列，選擇和確定尋找有效肽段的方法，并尋找該肽段所針對(duì)的抗原決定簇。合成中等大小的多肽也會(huì)涉及眾多反應(yīng)，每加入一個(gè)氨基酸需多次反應(yīng)，在一個(gè)氨基酸的α氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基縮合形成肽鏈之前，必須使其中一個(gè)形成高反應(yīng)的活化狀態(tài)，這個(gè)選擇自然落到羧基上，合成因而從C到N端。此外，氨基肽的側(cè)鏈基團(tuán)也能與活化羧基反應(yīng)，因此也必須保護(hù)起來(lái)。合成結(jié)束后必須除去所有的保護(hù)性基團(tuán)以得到所需的多肽。　　主要有兩個(gè)合成策略：片段濃縮法和固相合成法（merrifield法）。首先合成數(shù)條小肽，經(jīng)純化和去保護(hù)后結(jié)合成較長(zhǎng)的肽，直到最后所需的序列。通過(guò)在N－末端逐步加上氨基酸的方法合成肽段。在疫苗合成領(lǐng)域中，由于肽鏈聯(lián)接或裝配到需要的結(jié)構(gòu)（TADPs）及免疫原性構(gòu)架（MAPs）所用技術(shù)的引進(jìn)，加上肽鏈經(jīng)脂質(zhì)或碳水化合物的修飾作用，使得合成問(wèn)題變得更加復(fù)雜?！　《?、多肽疫苗的生產(chǎn)工藝及質(zhì)控　　（一）應(yīng)提供研制某一疫苗的詳細(xì)資料，包括選擇特定抗原決定簇的理由、對(duì)抗原決定簇的檢定，以及對(duì)載體、表位連接、結(jié)合劑、肽的呈遞方式及佐劑等的選擇理由及其相應(yīng)證據(jù)。內(nèi)容包括對(duì)每個(gè)表位來(lái)源的說(shuō)明，當(dāng)不止一個(gè)表位時(shí)，應(yīng)說(shuō)明把不同表位相互結(jié)合到一個(gè)已知序列內(nèi)的理由，此外還應(yīng)對(duì)表位的類型（B、Th、Tc等）及特殊組合方式進(jìn)行說(shuō)明。內(nèi)容包括：原料的來(lái)源和特性、使用的方法學(xué)、氨基酸的連接和脫保護(hù)，進(jìn)入下一步連接的判斷標(biāo)準(zhǔn)，任何加入的修飾基團(tuán)（例如糖基化，脂質(zhì)化）的詳細(xì)情況?！　。ㄋ模┤绻膯误w為中間產(chǎn)物，應(yīng)當(dāng)對(duì)其分離鑒定并提供下述確證依據(jù)。驗(yàn)證純度時(shí)應(yīng)采用多種技術(shù)對(duì)其理化特性盡可能多地檢查，特別要注意檢測(cè)生產(chǎn)或純化過(guò)程中可能加入的物質(zhì)；　　3．連續(xù)多批產(chǎn)品的肽質(zhì)量應(yīng)保持一致。對(duì)肽的純度、總雜質(zhì)、每種主要及次要雜質(zhì)都應(yīng)規(guī)定限度要求。　?。ㄆ撸?yīng)對(duì)肽的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并制定適當(dāng)?shù)馁A存期?！　。ň牛┹d體　　肽可以聯(lián)接或結(jié)合到載體上，選擇載體時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎，因?yàn)閷?duì)載體的免疫應(yīng)答可能會(huì)掩蔽對(duì)肽的免疫應(yīng)答。載體應(yīng)有自已的檔案材料及相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，它包括：載體的鑒定，生產(chǎn)一致性的證據(jù)，蛋白質(zhì)的安全性以及與蛋白質(zhì)、脂多糖、多聚體、脂質(zhì)體等相關(guān)的一些特征試驗(yàn)。對(duì)不同成分及雜質(zhì)應(yīng)鑒別定性并加以定量測(cè)定，對(duì)于生物來(lái)源的載體應(yīng)當(dāng)采取措施，確保檢測(cè)不出感染因子?！　。ㄊ唬┳魟?、防腐劑及其他添加成分為方便操作、增強(qiáng)穩(wěn)定性、延長(zhǎng)保存期以及修飾免疫原的類型和免疫原性，原則上可在免疫原中選擇添加許多成分。其中許多會(huì)產(chǎn)生自身的毒性，而且可能因與抗原聯(lián)合使用而顯著改變免疫反應(yīng)，從而引起安全性方面的其它顧慮。對(duì)已獲批準(zhǔn)的以鋁鹽及鈣鹽為基礎(chǔ)的佐劑，其標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)達(dá)到藥用等級(jí)（不含重金屬離子，質(zhì)量恒定，具有恒定的結(jié)合特征）。對(duì)于添加劑，應(yīng)提供所有成分的明確說(shuō)明，闡述使用的理由。此外，應(yīng)全面評(píng)價(jià)配方的抗原及毒性特征，特別注意不同成分的混合可能會(huì)導(dǎo)致抗原發(fā)生不良的修飾作用。單劑量制劑不應(yīng)添加防腐劑。因此應(yīng)確定配方的穩(wěn)定性，并以此建立合適貯存條件下的最大貨架期。　　三、產(chǎn)品的質(zhì)量與檢定要求　　保證多肽制品的一致性極其重要，應(yīng)廣泛使用分析技術(shù)?！　〕龖?yīng)符合常規(guī)的安全試驗(yàn)（如無(wú)菌、熱原試驗(yàn)及異常毒性試驗(yàn)），針對(duì)合成多肽的特點(diǎn)應(yīng)考慮：　?。ㄒ唬┘兌龋焊咝б合嗌V（HPLC）、毛細(xì)管電泳（CE）、陽(yáng)離子或陰離子色譜、等電聚焦，依據(jù)分子大小的鑒別技術(shù)（分子篩層析，還原、非還原SDS－PAGE 電泳），根據(jù)疏水性的鑒別技術(shù)（反相或疏水