【文章內(nèi)容簡介】 20512008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法_實時PCR法SN/T 25572010畜肉食品中牛成分定性檢測方法 實時熒光PCR法SN/T 29782011動物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測方法SN/T 食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第1部分:貂成分檢測 實時熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第2部分:狗成分檢測實時熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第3部分:狐貍成分檢測實時熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第4部分:驢成分檢測 實時熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第5部分:馬成分檢測 實時熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第6部分:貓成分檢測 實時熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第7部分:水牛成分檢測 實時熒PCR法SN/T 食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法 第8部分:豬成分檢測 實時熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第1部分:鶴鶉成分檢測PCR法SN/T 食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第2部分:鵝成分檢測PCR法SN/T 食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第3部分:鴿子成分檢測 實時熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第4部分:火雞成分檢測 實時熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第5部分:鴨成分檢測 PCR法SN/T 食品及飼料中常見禽類品種的鑒定方法 第6部分:鷓鴣成分檢測 實時熒光PCR法表1，動物源成分檢測的部分標(biāo)準(zhǔn)和方法Reference(1) ,Wiedemann, et al., species identification and quantification in meat and meat products using droplet digital PCR(ddPCR)。Food Chemistry 173(2015)10541058.(2) , , R. Lv et al., Quantitative Analysis of Pork and Chicken Products by Droplet Digital PCR。BioMed Research International Volum 2014. 肉類及肉類制品中的成分摻假和虛標(biāo)背景介紹當(dāng)前，對于研究者、消費(fèi)者、食品工業(yè)和政策制定者而言，食品安全都是一個熱點問題，尤其是肉類摻假和成分虛標(biāo)的問題。2013年“歐洲馬肉事件”和“沃爾瑪狐貍?cè)馐录钡纫幌盗械娜忸悡郊偈录槿忸惏踩庙懥司姡煞痔摌?biāo)更是存在于高達(dá)20％的食品檢測案例中（Ballin N Z et al., 2009）。食品安全是食品藥品檢驗檢測中心的一項重中之重的工作，因此如何快速有效的檢測肉類摻假及成分虛標(biāo)是需要解決的首要任務(wù)。檢測平臺與技術(shù)路線目前，對肉類樣品進(jìn)行分子檢測的技術(shù)分為兩大類：DNA分析和蛋白質(zhì)分析。蛋白質(zhì)分析主要有ELISA、LC等方法，但是由于靈敏度不高、操作復(fù)雜等特點其推廣應(yīng)用受到了很大的限制；DNA分析主要有瓊脂糖凝膠電泳分析（定性分析）、熒光定量PCR（qPCR）以及近幾年受到廣泛關(guān)注的數(shù)字PCR技術(shù)（dPCR）。本部分旨在通過介紹以ELISA、qPCR以及dPCR為基礎(chǔ)搭建的檢測平臺，為檢測工作提供更多簡便靈敏的可選方案。① ELISA檢測平臺（適用于所有的肉類制品）檢測背景：肉類成分鑒定的方法較多，其中ELISA的靈敏度相對較高，特異性好，而且操作相對簡單，易于推廣。本文旨在建立通用的ELISA檢測平臺以進(jìn)行肉類成分鑒定。 檢測平臺：Cooked Meat Species Identification Kit (ELISATEK, Gainesville,FL)及鑒定物種相對應(yīng)的單克隆抗體。檢測流程：將100種生鮮肉類和熟食樣品稱取25 g在水中攪碎并進(jìn)行攪拌，直到無塊狀物；將混合物100℃加熱15 min，濾出不溶物后用kit和單克隆抗體進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果：檢測試劑盒的LOD為1％。ELISA方法能夠特異性的鑒定各種肉類摻假成分。BioRad解決方案：BioRad提供xMARK、iMARK等不同系列的酶標(biāo)儀產(chǎn)品，體型小巧，操作簡單，同時具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析能力，能夠為日常的ELISA工作提供更多的幫助。另外，BioRad同時提供Western Blotting全套的V3解決方案，為蛋白質(zhì)印跡研究提供簡潔便利、定量精確的工作平臺。② qPCR檢測平臺（以牛肉和豬肉為例）檢測背景：常規(guī)的檢測肉類成分的手段包括ELISA、PAGE和PAGIF等蛋白質(zhì)分析技術(shù)，但由于肉類樣品加熱后蛋白質(zhì)變性而難以檢測出細(xì)微的成分區(qū)別；本研究試圖建立高效、靈敏的qPCR檢測平臺，以作為實驗室常規(guī)檢測手段。檢測平臺：qPCR平臺。牛肉檢測以磷酸二酯酶基因（bosPDE）為檢測位點，擴(kuò)增子長度為104bp，豬肉檢測以ryanodin gene中的108bp的片段（susRY）為檢測位點。檢測流程：待檢測樣品用改良的CTAB方法和蛋白酶K進(jìn)行處理，最后溶解于50μl的TE Buffer中。分別以FAM標(biāo)記susRY和bosPDE，進(jìn)行qPCR檢測。檢測結(jié)果：%（w/w），超過絕大部分的蛋白質(zhì)分析法；當(dāng)檢測豬肉時，如果制品里含有超過1％（w/w）的土雞肉時，會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，但其他情況特異性均非常好，因此可以作為肉類成分的常規(guī)檢測手段。BioRad解決方案：CFX96 Touch系列熒光定量PCR儀具有精確、快速、靈活三大優(yōu)勢，切實解決日常工作中核酸定量的繁瑣操作、性能不穩(wěn)定等缺點。精確：長壽命LED光源和一體化檢測器，壽命長，性能穩(wěn)定，掃描模式無光程差?？焖伲嚎焖偕禍?，支持fast PCR；即插即用，無需校正；溫度梯度功能，快速優(yōu)化實驗條件；真正5通道(450730nm)檢測。 靈活：可實現(xiàn)多臺儀器連接；真正單機(jī)運(yùn)行，實時顯示，可儲存100個結(jié)果。③ ddPCR檢測平臺 檢測背景：現(xiàn)有熒光定量PCR方法用來做絕對定量，但是因為DNA擴(kuò)增效率和擴(kuò)增質(zhì)量在對照和檢測樣品間存在差異，因此其應(yīng)用受到很大限制。檢測平臺：本文獻(xiàn)報道的ddPCR以gDNA的F2基因為標(biāo)記，采用拷貝數(shù)百分比的方法評估肉類及制品中的物種成份。檢測流程：待測樣品采用改良的CATB方法及加熱方法進(jìn)行DNA提取，后續(xù)采用ddPCR對線粒體CYTB基因和基因組中的F2基因分別進(jìn)行ddPCR檢測。檢測結(jié)果：相比現(xiàn)有的qPCR手段，%%的水平；之前的物種鑒定方法通常以線粒體DNA上CYTB基因為標(biāo)記，但是如果要定量分析物種成份，以線粒體為靶標(biāo)往往會得出過高或過低的結(jié)果（偏低70%至偏高160%），這是因為不同組織細(xì)胞中線粒體拷貝數(shù)差異極大，而F2基因是更合適的檢測靶點。檢測背景：肉類檢測中，qPCR由于其依賴于擴(kuò)增效率及標(biāo)準(zhǔn)曲線的特點應(yīng)用受到了極大的限制，本文獻(xiàn)致力于發(fā)展利用數(shù)字PCR建立完整的檢測平臺，以揭示ddPCR結(jié)果與成分含量之間的關(guān)系。檢測平臺：ddPCR檢測平臺。豬肉檢測是以Sus Scrofa betaactin (ACTB) gene（VIC）作為檢測靶點，雞肉檢測是以Gallus gallus transforming growth factor beta3 (TGFB3) gene（FAM）作為檢測位點。檢測流程：所有的用于驗證檢測方法靈敏度和特異性的樣品按照酚氯仿方法抽提DNA，經(jīng)過蛋白酶K消化后處理得到DNA。直接進(jìn)行ddPCR檢測。檢測結(jié)果：最終得到ddPCR結(jié)果得到的拷貝數(shù)濃度建立的DNA拷貝數(shù)/DNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線和DNA質(zhì)量/食品干重標(biāo)準(zhǔn)曲線兩條曲線，以這兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線代入樣品ddPCR結(jié)果得到的兩種基因拷貝數(shù)計算食品中不同成分的質(zhì)量和比例。BioRad解決方案：QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)以其無與倫比的準(zhǔn)確性和精確性為日常的核酸定量工作提供了極大的幫助。167。 真正的絕對定量，無需外參標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線，數(shù)據(jù)重復(fù)性更好167。 更高的準(zhǔn)確性，不再依賴PCR效率，抑制劑耐受度高，模板適用度廣167。 更高的分辨率，適合GMO等類型實驗167。 更高的靈敏度，最低可檢測到1個copy的targetReference [1] Ballin N Z, Vogensen F K, Karlsson A H. Species determination Can we detect and quantify meat adulteration?[J]. Meat Science, 2009, 83(2):165174.轉(zhuǎn)基因成分定性、定量檢測檢測背景隨著轉(zhuǎn)基因作物的全球性栽培和商業(yè)化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，越來越多的轉(zhuǎn)基因食品、食品配料和添加劑等進(jìn)入市場和餐桌，而轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的食用安全、環(huán)境安全風(fēng)險及倫理等問題越來越受到社會的關(guān)注和重視。截至2014年。全球60多個國家和地區(qū)制定了相關(guān)的法律和法規(guī)，要求對轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品(包括食品和飼料)進(jìn)行標(biāo)識管理。 Global Map of Biotech Crop Countries and MegaCountries in 2014目前，國際上對于轉(zhuǎn)基因標(biāo)識管理主要分為4類：一是自愿標(biāo)識，如美國、加拿大、阿根廷等；二是定量全面強(qiáng)制標(biāo)識，即對所有產(chǎn)品只要其轉(zhuǎn)基因成分含量超過閾值就必須標(biāo)識，%、巴西規(guī)定轉(zhuǎn)基因成分超過1%必須標(biāo)識；三是定量部分強(qiáng)制性標(biāo)識，即對特定類別產(chǎn)品只要其轉(zhuǎn)基因成分含量超過閾值就必須標(biāo)識，如日本規(guī)定對豆腐、玉米小食品、納豆等24種由大豆或玉米制成的食品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識，設(shè)定閾值為5%；四是定性按目錄強(qiáng)制標(biāo)識，即凡是列入目錄的產(chǎn)品，只要含有轉(zhuǎn)基因成分或者是由轉(zhuǎn)基因作物加工而成的，必須標(biāo)識。目前，我國是唯一采用定性按目錄強(qiáng)制標(biāo)識方法的國家，也是對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識最多的國家。截至2014年，我國已經(jīng)批準(zhǔn)55個轉(zhuǎn)基因作物事件，包括批準(zhǔn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因棉花、玉米、大豆，油菜等。對于這些轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的安全評價，轉(zhuǎn)基因成分的檢測是轉(zhuǎn)基因生物安全評價及標(biāo)識管理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我國已組建了國家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全委員會、全國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會等機(jī)構(gòu)發(fā)布轉(zhuǎn)基因生物安全標(biāo)準(zhǔn)，并認(rèn)定了40多個國家級的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)督檢驗測試機(jī)構(gòu)，承擔(dān)農(nóng)業(yè)部或申請人委托的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物定性定量檢測、鑒定和驗證實驗工作。轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法是對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行確定、生產(chǎn)和管理的必要手段，需要準(zhǔn)確有效的檢測技術(shù)得以實現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因作物的特點就是在其宿主基因組中導(dǎo)入一段外源DNA序列，這段序列進(jìn)行翻譯而表達(dá)出新的蛋白質(zhì)，從而使宿主獲得新的性狀，如對某些昆蟲的抗性或?qū)Τ輨┑哪托?。因此，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分的檢測，實質(zhì)就是檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中是否存在外源DNA序列或重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物。由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的特征是含有外源基因和表現(xiàn)出導(dǎo)入基因的性狀，因此，目前對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測采用的技術(shù)路線有兩條，檢測外源DNA序列或檢測外源基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)。對外源基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)常用的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法（EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay, ELISA）、蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）等；對外源DNA序列的檢測主要是基于聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）的方法，如定性PCR、實時熒光PCR法以及數(shù)字PCR方法等。這些方法不僅能確定樣品中是否存在轉(zhuǎn)基因物質(zhì)，還可以通過對一系列的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，對轉(zhuǎn)基因成分的含量提供相對定量或絕對定量的檢測結(jié)果。 Evolution of GMO detection methods and associated reference materials1999年，Vaitilingom等首次利用實時熒光PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)基因食品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了定量檢測，目前實時熒光PCR方法已經(jīng)成為食品中轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測最常用的方法。實時熒光PCR是一種通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量分析的方法，該技術(shù)可以對轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量分析，同時還具有靈敏度高、特異性和可靠性強(qiáng)、實時性和準(zhǔn)確性高等特點。實時熒光PCR方法要實現(xiàn)DNA的定量分析，需要一系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別構(gòu)建參照基因和目標(biāo)外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并最終通過計算外源基因序列與參照基因序列的量的比值實現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測。然而，該方法由于影響因素較多，如標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品的背景不同、不同基因擴(kuò)增效率的不同、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍（分析樣品必須落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的上下限范圍內(nèi)）、低拷貝DNA擴(kuò)增的重復(fù)性差等，均會造成定量結(jié)果的準(zhǔn)確性差；而且，目前轉(zhuǎn)基因品系的有效標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)難以得到制備和標(biāo)準(zhǔn)化，將導(dǎo)致大量的轉(zhuǎn)基因品系無法通過該方法進(jìn)行定量檢測。數(shù)字 PCR（digital PCR）是近年來在實時熒光 PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新一代DNA定量檢測技術(shù)。dPCR 是將 PCR 體系分配到大量的小的獨立反應(yīng)單元中，實現(xiàn)微反應(yīng)單元的單個DNA分子的 PCR 擴(kuò)增，結(jié)合熒光的終點檢測及泊松分布原理、根據(jù)陽性微滴與陰性微滴數(shù)的比例計算目標(biāo)DNA的拷貝數(shù)，實現(xiàn)絕對定量。dPCR方法降低了標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增效率對檢測結(jié)果的影響，擺脫了對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的依賴，即可實現(xiàn)對DNA分子的絕對定量；同時提高了低拷貝DNA擴(kuò)增的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。相比實時熒光PCR，dPCR具有更高的檢測靈敏度、精確性和重復(fù)性，同時無需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，是轉(zhuǎn)基因成分定量檢測的新方法。 數(shù)字PCR的基本原理轉(zhuǎn)基因成分檢測的技術(shù)平臺及檢測流程1) 定性PCR法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymera