【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 20512008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測(cè)方法_實(shí)時(shí)PCR法SN/T 25572010畜肉食品中牛成分定性檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 29782011動(dòng)物源性產(chǎn)品中雞源性成分PCR檢測(cè)方法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第1部分:貂成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第2部分:狗成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第3部分:狐貍成分檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第4部分:驢成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第5部分:馬成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第6部分:貓成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第7部分:水牛成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)畜類(lèi)品種的鑒定方法 第8部分:豬成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)禽類(lèi)品種的鑒定方法 第1部分:鶴鶉成分檢測(cè)PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)禽類(lèi)品種的鑒定方法 第2部分:鵝成分檢測(cè)PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)禽類(lèi)品種的鑒定方法 第3部分:鴿子成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)禽類(lèi)品種的鑒定方法 第4部分:火雞成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)禽類(lèi)品種的鑒定方法 第5部分:鴨成分檢測(cè) PCR法SN/T 食品及飼料中常見(jiàn)禽類(lèi)品種的鑒定方法 第6部分:鷓鴣成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法表1，動(dòng)物源成分檢測(cè)的部分標(biāo)準(zhǔn)和方法Reference(1) ,Wiedemann, et al., species identification and quantification in meat and meat products using droplet digital PCR(ddPCR)。Food Chemistry 173(2015)10541058.(2) , , R. Lv et al., Quantitative Analysis of Pork and Chicken Products by Droplet Digital PCR。BioMed Research International Volum 2014. 肉類(lèi)及肉類(lèi)制品中的成分摻假和虛標(biāo)背景介紹當(dāng)前，對(duì)于研究者、消費(fèi)者、食品工業(yè)和政策制定者而言，食品安全都是一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題，尤其是肉類(lèi)摻假和成分虛標(biāo)的問(wèn)題。2013年“歐洲馬肉事件”和“沃爾瑪狐貍?cè)馐录钡纫幌盗械娜忸?lèi)摻假事件為肉類(lèi)安全敲響了警鐘，成分虛標(biāo)更是存在于高達(dá)20％的食品檢測(cè)案例中（Ballin N Z et al., 2009）。食品安全是食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心的一項(xiàng)重中之重的工作，因此如何快速有效的檢測(cè)肉類(lèi)摻假及成分虛標(biāo)是需要解決的首要任務(wù)。檢測(cè)平臺(tái)與技術(shù)路線(xiàn)目前，對(duì)肉類(lèi)樣品進(jìn)行分子檢測(cè)的技術(shù)分為兩大類(lèi)：DNA分析和蛋白質(zhì)分析。蛋白質(zhì)分析主要有ELISA、LC等方法，但是由于靈敏度不高、操作復(fù)雜等特點(diǎn)其推廣應(yīng)用受到了很大的限制；DNA分析主要有瓊脂糖凝膠電泳分析（定性分析）、熒光定量PCR（qPCR）以及近幾年受到廣泛關(guān)注的數(shù)字PCR技術(shù)（dPCR）。本部分旨在通過(guò)介紹以ELISA、qPCR以及dPCR為基礎(chǔ)搭建的檢測(cè)平臺(tái)，為檢測(cè)工作提供更多簡(jiǎn)便靈敏的可選方案。① ELISA檢測(cè)平臺(tái)（適用于所有的肉類(lèi)制品）檢測(cè)背景：肉類(lèi)成分鑒定的方法較多，其中ELISA的靈敏度相對(duì)較高，特異性好，而且操作相對(duì)簡(jiǎn)單，易于推廣。本文旨在建立通用的ELISA檢測(cè)平臺(tái)以進(jìn)行肉類(lèi)成分鑒定。 檢測(cè)平臺(tái)：Cooked Meat Species Identification Kit (ELISATEK, Gainesville,FL)及鑒定物種相對(duì)應(yīng)的單克隆抗體。檢測(cè)流程：將100種生鮮肉類(lèi)和熟食樣品稱(chēng)取25 g在水中攪碎并進(jìn)行攪拌，直到無(wú)塊狀物；將混合物100℃加熱15 min，濾出不溶物后用kit和單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果：檢測(cè)試劑盒的LOD為1％。ELISA方法能夠特異性的鑒定各種肉類(lèi)摻假成分。BioRad解決方案：BioRad提供xMARK、iMARK等不同系列的酶標(biāo)儀產(chǎn)品，體型小巧，操作簡(jiǎn)單，同時(shí)具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析能力，能夠?yàn)槿粘５腅LISA工作提供更多的幫助。另外，BioRad同時(shí)提供Western Blotting全套的V3解決方案，為蛋白質(zhì)印跡研究提供簡(jiǎn)潔便利、定量精確的工作平臺(tái)。② qPCR檢測(cè)平臺(tái)（以牛肉和豬肉為例）檢測(cè)背景：常規(guī)的檢測(cè)肉類(lèi)成分的手段包括ELISA、PAGE和PAGIF等蛋白質(zhì)分析技術(shù)，但由于肉類(lèi)樣品加熱后蛋白質(zhì)變性而難以檢測(cè)出細(xì)微的成分區(qū)別；本研究試圖建立高效、靈敏的qPCR檢測(cè)平臺(tái)，以作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)手段。檢測(cè)平臺(tái)：qPCR平臺(tái)。牛肉檢測(cè)以磷酸二酯酶基因（bosPDE）為檢測(cè)位點(diǎn)，擴(kuò)增子長(zhǎng)度為104bp，豬肉檢測(cè)以ryanodin gene中的108bp的片段（susRY）為檢測(cè)位點(diǎn)。檢測(cè)流程：待檢測(cè)樣品用改良的CTAB方法和蛋白酶K進(jìn)行處理，最后溶解于50μl的TE Buffer中。分別以FAM標(biāo)記susRY和bosPDE，進(jìn)行qPCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果：%（w/w），超過(guò)絕大部分的蛋白質(zhì)分析法；當(dāng)檢測(cè)豬肉時(shí)，如果制品里含有超過(guò)1％（w/w）的土雞肉時(shí)，會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，但其他情況特異性均非常好，因此可以作為肉類(lèi)成分的常規(guī)檢測(cè)手段。BioRad解決方案：CFX96 Touch系列熒光定量PCR儀具有精確、快速、靈活三大優(yōu)勢(shì)，切實(shí)解決日常工作中核酸定量的繁瑣操作、性能不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。精確：長(zhǎng)壽命LED光源和一體化檢測(cè)器，壽命長(zhǎng)，性能穩(wěn)定，掃描模式無(wú)光程差。快速：快速升降溫，支持fast PCR；即插即用，無(wú)需校正；溫度梯度功能，快速優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件；真正5通道(450730nm)檢測(cè)。 靈活：可實(shí)現(xiàn)多臺(tái)儀器連接；真正單機(jī)運(yùn)行，實(shí)時(shí)顯示，可儲(chǔ)存100個(gè)結(jié)果。③ ddPCR檢測(cè)平臺(tái) 檢測(cè)背景：現(xiàn)有熒光定量PCR方法用來(lái)做絕對(duì)定量，但是因?yàn)镈NA擴(kuò)增效率和擴(kuò)增質(zhì)量在對(duì)照和檢測(cè)樣品間存在差異，因此其應(yīng)用受到很大限制。檢測(cè)平臺(tái)：本文獻(xiàn)報(bào)道的ddPCR以gDNA的F2基因?yàn)闃?biāo)記，采用拷貝數(shù)百分比的方法評(píng)估肉類(lèi)及制品中的物種成份。檢測(cè)流程：待測(cè)樣品采用改良的CATB方法及加熱方法進(jìn)行DNA提取，后續(xù)采用ddPCR對(duì)線(xiàn)粒體CYTB基因和基因組中的F2基因分別進(jìn)行ddPCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果：相比現(xiàn)有的qPCR手段，%%的水平；之前的物種鑒定方法通常以線(xiàn)粒體DNA上CYTB基因?yàn)闃?biāo)記，但是如果要定量分析物種成份，以線(xiàn)粒體為靶標(biāo)往往會(huì)得出過(guò)高或過(guò)低的結(jié)果（偏低70%至偏高160%），這是因?yàn)椴煌M織細(xì)胞中線(xiàn)粒體拷貝數(shù)差異極大，而F2基因是更合適的檢測(cè)靶點(diǎn)。檢測(cè)背景：肉類(lèi)檢測(cè)中，qPCR由于其依賴(lài)于擴(kuò)增效率及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的特點(diǎn)應(yīng)用受到了極大的限制，本文獻(xiàn)致力于發(fā)展利用數(shù)字PCR建立完整的檢測(cè)平臺(tái)，以揭示ddPCR結(jié)果與成分含量之間的關(guān)系。檢測(cè)平臺(tái)：ddPCR檢測(cè)平臺(tái)。豬肉檢測(cè)是以Sus Scrofa betaactin (ACTB) gene（VIC）作為檢測(cè)靶點(diǎn)，雞肉檢測(cè)是以Gallus gallus transforming growth factor beta3 (TGFB3) gene（FAM）作為檢測(cè)位點(diǎn)。檢測(cè)流程：所有的用于驗(yàn)證檢測(cè)方法靈敏度和特異性的樣品按照酚氯仿方法抽提DNA，經(jīng)過(guò)蛋白酶K消化后處理得到DNA。直接進(jìn)行ddPCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果：最終得到ddPCR結(jié)果得到的拷貝數(shù)濃度建立的DNA拷貝數(shù)/DNA質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和DNA質(zhì)量/食品干重標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)兩條曲線(xiàn)，以這兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)代入樣品ddPCR結(jié)果得到的兩種基因拷貝數(shù)計(jì)算食品中不同成分的質(zhì)量和比例。BioRad解決方案：QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)以其無(wú)與倫比的準(zhǔn)確性和精確性為日常的核酸定量工作提供了極大的幫助。167。 真正的絕對(duì)定量，無(wú)需外參標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，數(shù)據(jù)重復(fù)性更好167。 更高的準(zhǔn)確性，不再依賴(lài)PCR效率，抑制劑耐受度高，模板適用度廣167。 更高的分辨率，適合GMO等類(lèi)型實(shí)驗(yàn)167。 更高的靈敏度，最低可檢測(cè)到1個(gè)copy的targetReference [1] Ballin N Z, Vogensen F K, Karlsson A H. Species determination Can we detect and quantify meat adulteration?[J]. Meat Science, 2009, 83(2):165174.轉(zhuǎn)基因成分定性、定量檢測(cè)檢測(cè)背景隨著轉(zhuǎn)基因作物的全球性栽培和商業(yè)化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因食品、食品配料和添加劑等進(jìn)入市場(chǎng)和餐桌，而轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的食用安全、環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)及倫理等問(wèn)題越來(lái)越受到社會(huì)的關(guān)注和重視。截至2014年。全球60多個(gè)國(guó)家和地區(qū)制定了相關(guān)的法律和法規(guī)，要求對(duì)轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品(包括食品和飼料)進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理。 Global Map of Biotech Crop Countries and MegaCountries in 2014目前，國(guó)際上對(duì)于轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)管理主要分為4類(lèi)：一是自愿標(biāo)識(shí)，如美國(guó)、加拿大、阿根廷等；二是定量全面強(qiáng)制標(biāo)識(shí)，即對(duì)所有產(chǎn)品只要其轉(zhuǎn)基因成分含量超過(guò)閾值就必須標(biāo)識(shí)，%、巴西規(guī)定轉(zhuǎn)基因成分超過(guò)1%必須標(biāo)識(shí)；三是定量部分強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)，即對(duì)特定類(lèi)別產(chǎn)品只要其轉(zhuǎn)基因成分含量超過(guò)閾值就必須標(biāo)識(shí)，如日本規(guī)定對(duì)豆腐、玉米小食品、納豆等24種由大豆或玉米制成的食品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)，設(shè)定閾值為5%；四是定性按目錄強(qiáng)制標(biāo)識(shí)，即凡是列入目錄的產(chǎn)品，只要含有轉(zhuǎn)基因成分或者是由轉(zhuǎn)基因作物加工而成的，必須標(biāo)識(shí)。目前，我國(guó)是唯一采用定性按目錄強(qiáng)制標(biāo)識(shí)方法的國(guó)家，也是對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)最多的國(guó)家。截至2014年，我國(guó)已經(jīng)批準(zhǔn)55個(gè)轉(zhuǎn)基因作物事件，包括批準(zhǔn)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因棉花、玉米、大豆，油菜等。對(duì)于這些轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品的安全評(píng)價(jià)，轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)是轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)及標(biāo)識(shí)管理的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我國(guó)已組建了國(guó)家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全委員會(huì)、全國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)等機(jī)構(gòu)發(fā)布轉(zhuǎn)基因生物安全標(biāo)準(zhǔn)，并認(rèn)定了40多個(gè)國(guó)家級(jí)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試機(jī)構(gòu)，承擔(dān)農(nóng)業(yè)部或申請(qǐng)人委托的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物定性定量檢測(cè)、鑒定和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)工作。轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法是對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行確定、生產(chǎn)和管理的必要手段，需要準(zhǔn)確有效的檢測(cè)技術(shù)得以實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因作物的特點(diǎn)就是在其宿主基因組中導(dǎo)入一段外源DNA序列，這段序列進(jìn)行翻譯而表達(dá)出新的蛋白質(zhì)，從而使宿主獲得新的性狀，如對(duì)某些昆蟲(chóng)的抗性或?qū)Τ輨┑哪托?。因此，轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品中的轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)，實(shí)質(zhì)就是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中是否存在外源DNA序列或重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物。由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的特征是含有外源基因和表現(xiàn)出導(dǎo)入基因的性狀，因此，目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)采用的技術(shù)路線(xiàn)有兩條，檢測(cè)外源DNA序列或檢測(cè)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)。對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)常用的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay, ELISA）、蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）等；對(duì)外源DNA序列的檢測(cè)主要是基于聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）的方法，如定性PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR法以及數(shù)字PCR方法等。這些方法不僅能確定樣品中是否存在轉(zhuǎn)基因物質(zhì)，還可以通過(guò)對(duì)一系列的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測(cè)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的含量提供相對(duì)定量或絕對(duì)定量的檢測(cè)結(jié)果。 Evolution of GMO detection methods and associated reference materials1999年，Vaitilingom等首次利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品中的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行了定量檢測(cè)，目前實(shí)時(shí)熒光PCR方法已經(jīng)成為食品中轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)最常用的方法。實(shí)時(shí)熒光PCR是一種通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知樣品進(jìn)行定量分析的方法，該技術(shù)可以對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量分析，同時(shí)還具有靈敏度高、特異性和可靠性強(qiáng)、實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光PCR方法要實(shí)現(xiàn)DNA的定量分析，需要一系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別構(gòu)建參照基因和目標(biāo)外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并最終通過(guò)計(jì)算外源基因序列與參照基因序列的量的比值實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測(cè)。然而，該方法由于影響因素較多，如標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和樣品的背景不同、不同基因擴(kuò)增效率的不同、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍（分析樣品必須落在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的上下限范圍內(nèi)）、低拷貝DNA擴(kuò)增的重復(fù)性差等，均會(huì)造成定量結(jié)果的準(zhǔn)確性差；而且，目前轉(zhuǎn)基因品系的有效標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)難以得到制備和標(biāo)準(zhǔn)化，將導(dǎo)致大量的轉(zhuǎn)基因品系無(wú)法通過(guò)該方法進(jìn)行定量檢測(cè)。數(shù)字 PCR（digital PCR）是近年來(lái)在實(shí)時(shí)熒光 PCR 基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新一代DNA定量檢測(cè)技術(shù)。dPCR 是將 PCR 體系分配到大量的小的獨(dú)立反應(yīng)單元中，實(shí)現(xiàn)微反應(yīng)單元的單個(gè)DNA分子的 PCR 擴(kuò)增，結(jié)合熒光的終點(diǎn)檢測(cè)及泊松分布原理、根據(jù)陽(yáng)性微滴與陰性微滴數(shù)的比例計(jì)算目標(biāo)DNA的拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。dPCR方法降低了標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及擴(kuò)增效率對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，擺脫了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的依賴(lài)，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA分子的絕對(duì)定量；同時(shí)提高了低拷貝DNA擴(kuò)增的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。相比實(shí)時(shí)熒光PCR，dPCR具有更高的檢測(cè)靈敏度、精確性和重復(fù)性，同時(shí)無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，是轉(zhuǎn)基因成分定量檢測(cè)的新方法。 數(shù)字PCR的基本原理轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)的技術(shù)平臺(tái)及檢測(cè)流程1) 定性PCR法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymera