dbs45023-20xx食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)水牛乳及其制品中摻入牛屬乳的定性檢測(cè)pcr法(編輯修改稿)
2025-08-10 22:38 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 度和純度的測(cè)定取5181。L DNA溶液加雙蒸水稀釋至1mL，用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)分別檢測(cè)260nm和280nm處的吸光值 A260和 A280。DNA的濃度按照式（1）計(jì)算：c=AN50/1000 ……………………（1）式中：c——DNA 濃度，單位為微克每微升（181。g/181。L）；A——260 nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng) A260/，適宜于PCR擴(kuò)增?！?PCR擴(kuò)增在冰浴條件下，按25181。L的PCR反應(yīng)體系用量在PCR反應(yīng)管中分別加入各PCR試劑，每個(gè)樣本做三個(gè)平行，同時(shí)PCR擴(kuò)增陽(yáng)性摻入對(duì)照、陰性摻入對(duì)照和陰性質(zhì)控對(duì)照。25 181。L的 PCR 反應(yīng)體系試劑用量如下：PCR Buffer（5）5181。L、MgCl2（25mmol/L）、Taq DNA聚合酶（1U/181。L）、引物B1（10 181。M/L）和B2（10 181。M/L）、引物C1（10 181。M/L）1181。L、dNTPs 混合物（10 mM/L）、模板 DNA（ 181。g~ 181。g）2181。L、滅菌雙蒸水8181。L。除按上述配制外，也可采用 PCR Mix試劑盒。加完試劑后瞬時(shí)離心混勻，將PCR反應(yīng)管均置于PCR儀內(nèi)，按下面反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)： 94℃，3min；然后進(jìn)入94℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸45s的循環(huán)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃，10 min；4℃結(jié)束擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物直接進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析或置4℃保存?zhèn)溆谩！?電泳 %瓊脂糖凝膠制備制備方法見(jiàn)附錄 E?！?加樣分別將樣品、陽(yáng)性摻入對(duì)照、陰性摻入對(duì)照和陰性質(zhì)控對(duì)照的5181。L PCR 產(chǎn)物與 1181。L 6DNA電泳上樣緩沖液混合均勻，加至瓊脂糖凝膠樣品孔中（如用含Loading dye 的PCR Mix試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)可直接上樣），同時(shí)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) DNA 分子量對(duì)照?！?電泳條件調(diào)整電泳儀至70V電泳約45min，直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)離瓊脂糖凝膠末端 2cm～3cm 時(shí)停止。7 結(jié)果判定將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察，與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量比較，只有陽(yáng)性摻入對(duì)照、陰性摻入對(duì)照和陰性質(zhì)控對(duì)照結(jié)果正確時(shí)才能進(jìn)行受檢樣品的結(jié)果判定，然后拍照保存。如果樣品僅在220 bp位置出現(xiàn)水牛特異性條帶，判定為純水牛乳或純水牛乳制品。如果樣品僅在346bp 位置出現(xiàn)牛屬特異性條帶或沒(méi)有條帶，則判為非水牛乳或非水牛乳制品。如果樣品在 220bp位置出現(xiàn)水牛屬特異性條帶，且同時(shí)在346bp位置出現(xiàn)牛屬特異性條帶，則判為摻假水牛乳或摻假水牛乳制品。注：。附 錄 A（規(guī)范性附錄）水牛屬和牛屬特異性片段序列 水牛屬特異性片段序列CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCGATAGACCTCACCAATTCTTGCTAATGCAGTCTATATACCGCCATCTTCAGCGAACCCTAAAAAGGTACAAAAGTAAGCGCAATCACAACGCATAAAAACGTTAGGTCAAGGTGTAACCTATGAAATGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTACACCAAGAACACCCAACACGAAAGTTATTATGAAA 牛屬特異性片段序列CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCGATAAACCTCACCAATTCTTGCTAATACAGTCTATATACCGCCATCTTCAGCAAACCCTAAAAAGGAAAAAAAGTAAGCGTAATTATGATACATAAAAACGTTAGGTCAAGGTGTAACCTATGAAATGGGAAGAAATGGGCTACATTCTCTA
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