dbs45023-20xx食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)水牛乳及其制品中摻入牛屬乳的定性檢測pcr法(參考版)
2025-07-17 22:38本頁面
【正文】 。待凝膠完全凝固后，撤去兩端膠帶?！?將托架放入電泳槽中，加入 1倍 Tris硼酸電泳緩沖液，使之浸過膠面 2 mm，拔出梳子，以備加樣電泳待瓊脂糖溶液冷至 50 ℃ 時，加入核酸染料GelRed 10μL，充分混合(避免起泡)。將膠液沿托架膠板邊緩慢連續(xù)注入，讓膠液自由流向各方，凝膠厚度控制在3mm～5mm之間。 配制足夠量的凝膠：稱取 瓊脂糖于三角瓶中，加入100mL 1 倍Tris硼酸電泳緩沖液，加熱溶解瓊脂糖。L上清液到一新的2mL EP管中，加入等體積的氯仿異戊醇（氯仿：異戊醇=24：1），充分混勻，室溫靜置3min，12000rpm/min，離心10min； EP管中，充分混勻后置于20℃沉淀DNA半小時以上； 12000rpm/min，4℃離心15min收集沉淀，小心傾去上清后加入1mL的75%乙醇洗滌沉淀2次； 室溫下晾干沉淀后加入適量的TE溶解沉淀，20℃保存?zhèn)溆谩！?冷卻至室溫，2500rpm/mim離心5min后取1000181。附 錄 D （規(guī)范性附錄）用酚氯仿異戊醇法提取DNA的步驟 ； 根據(jù)最終離心獲得的沉淀量，每200mg沉淀量加入1mL的消化緩沖液，同時加入蛋白酶K至終濃度為100181?！?1 倍 Tris硼酸電泳緩沖液的配制 1 倍 Tris硼酸電泳緩沖液按下列方法進(jìn)行配制：—— 5倍 Tris硼酸電泳緩沖液：100 mL；—— 雙蒸水：400 mL?！?Tris硼酸電泳緩沖液的配制 5 倍Tris硼酸電泳緩沖液的配制 5 倍 Tris硼酸電泳緩沖液按下列方法進(jìn)行配制：—— Tris：；—— 硼酸：；—— mol/L EDTA (pH )：20 mL；—— 雙蒸水：定容至 1 000mL?！?100mmol/L TrisCl 100mmol/L TrisCl ：—— Tris堿： g；—— 雙蒸水：定容至 100 mL；在 80 ml 雙蒸水中加入 Tris 堿，待溶液冷至室溫后，加入濃鹽酸調(diào) PH ，然后定容至 100 ml，分裝后 105 Pa 高壓滅菌 30min。 TE 的配制TE 按下列方法進(jìn)行配制：—— 100 mmol/L TrisCl PH ；—— 10 mmol/L EDTA pH ；分裝后 105 Pa 高壓滅菌 30 min?！?3 mol/L NaAc 的配制3 mol/L NaAc 按下列方法進(jìn)行配制：—— NaAc：；—— 雙蒸水：定容至1 000 mL；在 800 mL 雙蒸水中加入 NaAc，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，調(diào)節(jié)溶液 pH ，然后定容至1 000 mL，分裝后 105 Pa 高壓滅菌 30 min。定容至終體積10 mL。室溫保存。室溫保存。2H2O)： g；—— 氫氧化鈉： g；—— 雙蒸水：定容至1 000 mL；在 800 mL 雙蒸水中加入 EDTANa2室溫保存。表 引物種類引物名稱特異性引物的核苷酸序列片段長度水牛特性引物C15’CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA3’220bpB15’TTTCATAATAACTTTCGTGTTGGGTGT3’牛屬特性引物C15’CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA3’346bpB25’TAAATAGGGTTAGATGCACTGAATCCAT3’ PCR 檢測結(jié)果電泳圖示以水牛特異性引物和牛屬特異性引物進(jìn)行雙重PCR的電泳圖
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