dbs45023-20xx食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)水牛乳及其制品中摻入牛屬乳的定性檢測pcr法-文庫吧資料
2025-07-20 22:38本頁面
【正文】 圖 PCR檢測結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳圖示M、標(biāo)準(zhǔn) DNA 分子量（100 bp ladder DNA marker）；陽性摻入對照； 純水牛乳或純水牛乳制品； 3和非水牛乳或非水牛乳制品； 摻假水牛乳或摻假水牛乳制品； 陰性摻入對照； 陰性質(zhì)控對照。注：。如果樣品僅在346bp 位置出現(xiàn)牛屬特異性條帶或沒有條帶，則判為非水牛乳或非水牛乳制品。7 結(jié)果判定將電泳后的瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察，與標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量比較，只有陽性摻入對照、陰性摻入對照和陰性質(zhì)控對照結(jié)果正確時才能進行受檢樣品的結(jié)果判定，然后拍照保存。L 6DNA電泳上樣緩沖液混合均勻，加至瓊脂糖凝膠樣品孔中（如用含Loading dye 的PCR Mix試劑盒進行PCR反應(yīng)可直接上樣），同時設(shè)置標(biāo)準(zhǔn) DNA 分子量對照?！?加樣分別將樣品、陽性摻入對照、陰性摻入對照和陰性質(zhì)控對照的5181。PCR 產(chǎn)物直接進行瓊脂糖凝膠電泳分析或置4℃保存?zhèn)溆?。除按上述配制外，也可采?PCR Mix試劑盒。L、滅菌雙蒸水8181。g~ 181。M/L）1181。M/L）和B2（10 181。L、MgCl2（25mmol/L）、Taq DNA聚合酶（1U/181。25 181。 PCR擴增在冰浴條件下，按25181。L）；A——260 nm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。DNA的濃度按照式（1）計算：c=AN50/1000 ……………………（1）式中：c——DNA 濃度，單位為微克每微升（181?！?DNA濃度和純度的測定取5181。DNA 提取后置于20℃保存?！?水牛乳干酪樣品的DNA提取取2g干酪樣品，充分研碎后置于50 mL離心管中；然后向離心管中加入20mL ，搗碎并劇烈震蕩使沉淀懸浮，2500r/min離心20min，用小勺撇去離心管上層的乳脂，再用吸管將上清液吸出，保留最底部的沉淀，再用無菌棉球擦除離心管壁上殘存乳脂；如果乳脂殘存過多，再次重復(fù)向離心管中加入20mL 、離心、除脂的操作步驟；按照食品專用DNA抽提試劑盒中步驟抽提DNA。DNA提取除采用試劑盒外，也可采用酚氯仿異戊醇法(用酚氯仿異戊醇法提取DNA的步驟見附錄D)提取。DNA提取后置于20℃保存。6 操作程序 待檢樣品的DNA抽提 生水牛乳及液態(tài)水牛乳制品樣品的DNA提取取50mL乳樣于50mL離心管中，2500r/min離心20min，用小勺撇去離心管上層的乳脂，再用吸管將上清液吸出，保留最底部的沉淀，用無菌棉球或棉簽擦除離心管壁上殘存乳脂；然后向離心管中加入20mL ，輕輕敲打離心管使沉淀懸浮，2500 r/min離心20 min，用吸管將上清液吸出，保留最底部的沉淀，再用無菌棉球擦除離心管壁上殘存乳脂；如果乳脂殘存過多，再次重復(fù)向離心管中加入20mL PBS、離心、除脂的操作步驟；最后將上清液吸出，保留最底部的沉淀；按照食品專用DNA抽提試劑盒中步驟抽提DNA。L、10181?！?一次性耗材一次性PE手套；離心管：；PCR反應(yīng)管：；吸頭：1 000181。L～100181。L～200181。L～1 000181?！?試劑配制方法試劑配制方法見附錄 C。核酸染料GelRed；6DNA電泳上樣緩沖液；1倍Tris硼酸電泳緩沖液?；蛴玫刃У氖称穼Ｓ肈NA抽提試劑盒?！?試劑除另有規(guī)定外，所用生化試劑均為分析純，水為符合GB/T 66821992的滅菌雙蒸水或超純水。5 試驗材料 特異性引物根據(jù)12S rRNA基因的核苷酸序列設(shè)計引物，其中一條為水牛與牛屬牛12S rRNA的通用引物，另兩條分別為擴增水牛12S rRNA基因與牛屬牛12S rRNA基因的特異
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