【文章內(nèi)容簡介】 、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過氧化氫的有效清除和新的蛋白質(zhì)氧化折疊通路等問題。鑒定Ero1α、Ero1β與Prx4的亞硝基化修飾及谷胱甘肽化修飾位點(diǎn)，體內(nèi)外研究巰基修飾對(duì)酶活性的影響，在細(xì)胞水平檢測巰基修飾對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)氧化折疊過程的影響。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化折疊相關(guān)蛋白質(zhì)的巰基修飾的生理意義。 3. 線粒體的氧化折疊 聯(lián)合利用生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段，在原子分辨率水平上闡明線粒體膜間隙蛋白質(zhì)氧化折疊時(shí)的電子傳遞機(jī)理，完善線粒體膜間隙蛋白成熟過程中的氧化折疊體系。我們選用最經(jīng)典的真核生物研究模型釀酒酵母，解析Mia40Erv1和Mia40底物蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，解析粒體膜間隙中血紅素/銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和其他具有重要生物學(xué)功能的蛋白的結(jié)構(gòu)，測量線粒體膜間隙中已知的血紅素/銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，分析血紅素/銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與底物蛋白的復(fù)合物的之間相互作用的界面，總結(jié)共同特征，在原子分辨率水平上揭示Mia40Erv1依賴的氧化折疊體系和血紅素/銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)體系的工作原理。 4. 蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系相關(guān)蛋白質(zhì)的巰基氧化還原修飾研究 鑒定分子伴侶、泛素化降解途徑關(guān)鍵蛋白和自噬過程相關(guān)蛋白的巰基修飾位點(diǎn)。體外研究分子伴侶被修飾后生化性質(zhì)及活性的改變，體內(nèi)研究巰基修飾對(duì)其功能的影響。研究泛素化降解途徑受氧化應(yīng)激/氮應(yīng)激的調(diào)控機(jī)制以及泛素化途徑失常導(dǎo)致的錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)聚集與細(xì)胞效應(yīng)。研究關(guān)鍵蛋白發(fā)生巰基修飾后對(duì)自噬的調(diào)控機(jī)制，以及在氧化應(yīng)激/氮應(yīng)激條件下，自噬過程對(duì)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊蛋白的清除機(jī)制。以CFTR、αSynuclein以及酵母Prion蛋白Ure2等蛋白為模型蛋白，在體內(nèi)外研究蛋白質(zhì)質(zhì)量控制體系相關(guān)蛋白的巰基修飾對(duì)的淀粉樣纖維化的影響。研究小分子化合物對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制過程中關(guān)鍵蛋白巰基修飾的調(diào)控作用，篩選具有調(diào)控功能的小分子化合物藥物先導(dǎo)物。 5. 巰基修飾酶的作用機(jī)制及生理功能研究： 研究具有GRX活性的酵母Prion蛋白Ure2新穎的酶促反應(yīng)機(jī)制，Ure2的GRX活性在體內(nèi)的生理意義。研究Ure2的 GRX活性的催化反應(yīng)步驟；分析Ure2與反應(yīng)中間體之間的相互作用，確定相互作用殘基及電子轉(zhuǎn)移機(jī)制，從而闡明Ure2的GRX活性的催化機(jī)制。在正常和應(yīng)激條件下，通過已建立的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測方法，比較Ure2存在、缺失以及處于Prion狀態(tài)時(shí)，酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞硝基化和谷胱甘肽化修飾情況，而闡釋Ure2的GRX活性可能的生理功能。 經(jīng)費(fèi)比例： 37% 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院生物物理研究所、中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： Sarah Perrett 學(xué)術(shù)骨干： 王志珍、周叢照、陳暢、黃麗華、陳立君課題3 ： 蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊及分子伴侶的作用 預(yù)期目標(biāo)： 蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、淀粉樣聚集和包涵體的形成與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生緊密相關(guān)。研究蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊發(fā)生的內(nèi)在和外部原因，錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的復(fù)性和降解的平衡調(diào)控，大分子擁擠和蛋白質(zhì)包涵體的形成及對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)，分子伴侶對(duì)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和包涵體形成的影響及其質(zhì)量控制。通過理解細(xì)胞內(nèi)外蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊發(fā)生的規(guī)律機(jī)制和分子伴侶的作用，為相關(guān)疾病（如神經(jīng)退行性疾?。┑陌l(fā)生和病理機(jī)制以及可能的預(yù)防和治療提供重要依據(jù)。 主要研究內(nèi)容： 綜合應(yīng)用生物化學(xué)、分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的先進(jìn)技術(shù)方法，研究神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和包涵體的形成，分子伴侶以及輔伴侶在蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊的發(fā)生和清除中的調(diào)節(jié)作用。 1. 蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，淀粉樣聚集和包涵體形成 (1) 蛋白質(zhì)淀粉樣聚集和纖維化的分子機(jī)制 通過檢測蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光和應(yīng)用停流與平衡結(jié)合的技術(shù)，詳細(xì)測定一些使體內(nèi)Prion傳播特點(diǎn)發(fā)生改變的Ure2突變體的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)折疊特征，將其與我們已經(jīng)得到的野生型蛋白質(zhì)的參數(shù)進(jìn)行比較。還將嘗試這些突變體的結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析，以期獲得詳細(xì)的結(jié)構(gòu)變化信息。采用包含polyQ序列和小的完好折疊的Huntingtin （Htt）蛋白的HEATrepeat結(jié)構(gòu)域的嵌合體蛋白，研究鄰近的HEATrepeat蛋白結(jié)構(gòu)域的存在對(duì)polyQ序列聚集性質(zhì)的調(diào)節(jié)，以及鄰近的polyQ序列對(duì)HEATrepeat結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和折疊性質(zhì)的影響。 (2) 翻譯后修飾及大分子擁擠對(duì)蛋白質(zhì)聚集的調(diào)控 以人Prion 和Ataxin3 （Atx3） 等蛋白質(zhì)為對(duì)象，結(jié)合體內(nèi)和體外研究方法，研究糖基化、磷酸化修飾，泛素化修飾和GPI 定位修飾以及大分子擁擠對(duì)模型蛋白質(zhì)聚集的調(diào)控機(jī)制。比較在生理擁擠環(huán)境和稀溶液中，翻譯后修飾的蛋白質(zhì)與無修飾的蛋白質(zhì)的分子效應(yīng)和功能差異，檢測這些特異性修飾以及大分子擁擠對(duì)于這些模型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、聚集和纖維化程度的影響，以及對(duì)Prion蛋白的蛋白酶抗性和感染性的影響。闡述翻譯后修飾及大分子擁擠對(duì)于蛋白質(zhì)病理性聚集的細(xì)胞效應(yīng)及Prion蛋白傳播中的作用。 (3) 蛋白質(zhì)聚集和細(xì)胞內(nèi)包涵體形成 我們的前期研究表明αSynuclein/Synphilin1 （αSyn/Sph1） 間的相互作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)包涵體（Inclusion Bodies）形成有顯著的影響。將用NMR、熒光及其它生化方法體外篩選和設(shè)計(jì)能夠阻止αSyn/Sph1兩者相互作用以及αSyn聚集和包涵體形成的小分子化合物；并在細(xì)胞模型中驗(yàn)證這些化合物對(duì)αSyn聚集和包涵體形成以及細(xì)胞毒性的影響。TDP43 蛋白（TAR DNA Binding Protein of 43 kDa）的沉積與肌萎縮側(cè)索硬化癥的發(fā)生相關(guān)。我們將研究TDP43蛋白聚集的內(nèi)在序列因素，細(xì)胞內(nèi)形成包涵體的原因和對(duì)細(xì)胞的效應(yīng)和功能喪失。主要探索一些因素包括遺傳突變、錯(cuò)誤的細(xì)胞定位、生化修飾、降解片段和RNA結(jié)合等對(duì)TDP43功能喪失和細(xì)胞毒性的影響。 2. 分子伴侶和輔伴侶對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的作用 (1) 分子伴侶對(duì)Prion蛋白、Tau蛋白錯(cuò)誤折疊和聚集的作用 以人Prion蛋白及其病理突變體，過磷酸化修飾的Tau蛋白及其病理突變體為研究對(duì)象，用各種生化和細(xì)胞技術(shù)研究分子伴侶Hsp70A1A（Hsp70家族成員）和ERp57（PDI家族成員）對(duì)這兩個(gè)蛋白質(zhì)病理性錯(cuò)誤折疊的調(diào)控機(jī)制。闡釋分子伴侶在疾病發(fā)生機(jī)制中的作用，進(jìn)而運(yùn)用分子生物學(xué)方法設(shè)計(jì)出能夠抑制病理性錯(cuò)誤折疊的分子伴侶。 (2) 分子伴侶對(duì)Prion傳播及polyQ蛋白聚集的調(diào)控 結(jié)合體內(nèi)和體外方法，探測Hsp70突變體影響Prion傳播的生物化學(xué)基礎(chǔ)，以及Hsp70的輔分子伴侶在這種影響中的貢獻(xiàn)。在體外檢測影響Prion傳播的Hsp70突變體的ATPase活性和肽結(jié)合能力，與Hsp104和/或Hsp40協(xié)同作用的能力，以及與Ure2相互作用和抑制淀粉樣纖維化的能力。將在體外和體內(nèi)研究Hsp70的結(jié)構(gòu)域缺失突變體，了解它的三個(gè)結(jié)構(gòu)域在Prion治愈中各自的作用。檢測分子伴侶對(duì)Prion傳播發(fā)生改變的Ure2突變體的折疊和聚集的影響，進(jìn)而在體內(nèi)檢驗(yàn)。包括Hsp70/HspHsp104 、GroEL 和TriC在內(nèi)的分子伴侶已被發(fā)現(xiàn)能在動(dòng)物、細(xì)胞和體外模型抑制Huntingtin （Htt）的N端片段的聚集。我們將檢測Htt及相關(guān)嵌合體的折疊和聚集性質(zhì)如何受分子伴侶調(diào)控。 (3) 雙功能輔伴侶蛋白對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制的作用 有一類輔伴侶分子，它們既包括與分子伴侶相互作用的結(jié)構(gòu)域，又有參與泛素蛋白質(zhì)酶體作用的結(jié)構(gòu)域。我們的前期工作已發(fā)現(xiàn)輔伴侶蛋白HSJ1a可以雙向調(diào)節(jié)Atx3的蛋白質(zhì)水平，其N端J結(jié)構(gòu)域與Hsp70作用，可以減少細(xì)胞內(nèi)Atx3蛋白的量，而C端的雙UIM結(jié)構(gòu)域參與泛素結(jié)合相關(guān)的作用，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)Atx3蛋白的水平。我們將以Atx3或αSyn蛋白為模型，研究雙功能輔伴侶蛋白如CHIP、HSJUSP1BAG6 （BAT3）等通過分子伴侶和泛素蛋白酶體兩大系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的質(zhì)和量的調(diào)控。 經(jīng)費(fèi)比例： 18% 承擔(dān)單位： 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院、武漢大學(xué) 課題負(fù)責(zé)人： 胡紅雨 學(xué)術(shù)骨干： 梁毅、宋愛新、杜芬課題4 ： 蛋白質(zhì)異常修飾與相關(guān)疾病的關(guān)系預(yù)期目標(biāo)： 通過多種方法手段研究神經(jīng)系統(tǒng)重要功能蛋白質(zhì)的異常修飾（過度磷酸化、糖基化等）的誘導(dǎo)因素、分子細(xì)胞機(jī)制；蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊、分子聚集、神經(jīng)細(xì)胞死亡與認(rèn)知功能損傷之間的關(guān)系。建立能夠試用于臨床檢驗(yàn)老年性癡呆癥的生物化學(xué)方法，為老年性癡呆癥的早期診斷、藥物設(shè)計(jì)等提供新的方案。主要研究內(nèi)容：1. 異常磷酸化、非酶促糖基化的細(xì)胞與動(dòng)物模型建立建立醛誘導(dǎo)的過度磷酸化、糖基化等細(xì)胞模型、小鼠以及大鼠模型，測定導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生“醛應(yīng)激”的醛及其衍生物之間的關(guān)系與時(shí)間動(dòng)力過程；并對(duì)所建立的細(xì)胞、動(dòng)物模型代謝狀況進(jìn)行評(píng)估，使得所建立的細(xì)胞及動(dòng)物模型具有可重復(fù)性；在必要情況下建立非人靈長類模型。2. 神經(jīng)系統(tǒng)重要蛋白質(zhì)的異常磷酸化、非酶促糖基化機(jī)制通過申請(qǐng)者所建立的異常磷酸化、糖基化細(xì)胞和動(dòng)物模型，研究甲醛、核糖等誘導(dǎo)的神經(jīng)Tau、αSynuclein、Aβ等蛋白磷酸化位點(diǎn)及程度；參與神經(jīng)系統(tǒng)蛋白過度磷酸化的激酶及其調(diào)控機(jī)制，包括磷酸化酶系統(tǒng)的調(diào)控狀態(tài)等，即“醛應(yīng)激”的細(xì)胞調(diào)控通訊網(wǎng)絡(luò)；在“甲醛應(yīng)激”情況下神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)及發(fā)生機(jī)制。3. 異常磷酸化、非酶促糖基化及其相互作用網(wǎng)絡(luò)過度磷酸化對(duì)神經(jīng)Tau、Aβ、αSynuclein、SNAREs等蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響；神經(jīng)Tau蛋白等過度磷酸化的生物學(xué)意義，包括在細(xì)胞核內(nèi)保護(hù)DNA功能的改變等；在建立“醛應(yīng)激”細(xì)胞和動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，檢測甲醛誘導(dǎo)神經(jīng)元中GSK3β磷酸化位點(diǎn)及程度；GSK3β對(duì)線粒體動(dòng)態(tài)平衡和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，及在老年性癡呆癥模型所致神經(jīng)元凋亡和認(rèn)知功能損傷中的作用；BDNF的調(diào)控并改善神經(jīng)元在應(yīng)激狀態(tài)的功能；利用甲醛慢性認(rèn)知功能損傷的細(xì)胞模型、鼠模型以及非人靈長類模型，研究蛋白質(zhì)異常修飾、相互作用的網(wǎng)絡(luò)與神經(jīng)細(xì)胞變性之間關(guān)系。4. 異常磷酸化、糖基化與認(rèn)知功能損傷研究神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質(zhì)異常修飾與認(rèn)知功能的損傷。從分子、細(xì)胞及整體水平研究醛類對(duì)SNAREs（soluble NSFattachment protein receptors）及αSynuclein等蛋白質(zhì)異常修飾對(duì)突觸小泡上vSNARE蛋白，VAMP2/Syntaptobrevin2，與膜上tSNARE蛋白，syntaxin1和SNAP25蛋白的組分變化及異常聚集，影響神經(jīng)遞質(zhì)外排功能、損傷突觸間聯(lián)絡(luò)，在探索蛋白質(zhì)異常修飾的機(jī)制及其相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的相互作用的基礎(chǔ)上，闡明蛋白質(zhì)異常修飾與認(rèn)知損傷之間的關(guān)系。 5. 內(nèi)源性甲醛作為生物標(biāo)記物用于臨床診斷的基礎(chǔ)研究