【文章內容簡介】 直到反應呈陰性為止。再分別從每個試管各取出1滴蛋白液置磁反應板上加入50g/L醋酸鋇，直至檢查出現白色的BaSO4沉淀為止，將含蛋白質而無硫酸銨的溶液合并，此即為已脫鹽的球蛋白溶液，待進一步純化。6．凝膠的再生與保存：葡聚糖凝膠可柱內再生，故凝膠層析柱可重復使用，每次用完后以醋酸銨溶液進行充分洗滌，留待再用。為防止凝膠霉變，%疊氮化鈉的醋酸銨溶液進行流洗后再放置。長時間不用，宜將凝膠從柱內倒出，以濕態(tài)保存，%疊氮化鈉置4oC冰箱內，可放置幾個月至一年，不需要干燥。如凝膠柱有輕微污染。 （三）純化 1．DEAE纖維素處理：，攪拌后放置30分鐘，加蒸餾水250ml，攪勻，待纖維素大部分下沉后，棄去含有細微顆粒的上層液體，如此反復23次，，攪拌后放置30分鐘，棄取上層液體，棄上層液體后加醋酸銨溶液約200ml,用1mol/（約5ml），留待裝柱。 2．裝柱：與葡聚糖凝膠層析裝柱法相同。 ：、平衡的方法、時間同葡聚糖凝膠層析。 ：將脫鹽收集的球蛋白溶液上柱，方法過程與脫鹽法相同。 ：用pH ，流速2030滴/分，方法與上述脫鹽法相同，同樣用200g/L磺基水楊酸檢查有無蛋白流出。此次收集的即為純化的γ球蛋白溶液，留待濃縮及鑒定。 ：，（）洗滌平衡后可重復使用。 （四）濃縮 將純化后的γ球蛋白溶液量其體積，吸收水分，搖動23分鐘，離心5分鐘（3000轉/分），上清液即為濃縮的γ球蛋白溶液，用吸管吸至另一個小試管中，留待電泳鑒定。 （五）電泳法鑒定 1．準備：在2180。，表示點樣的位置。 ：將薄膜無光澤面向下，漂浮于巴比妥緩沖液面上，使膜條自然浸濕下沉，浸泡一般要大于2小時，最好過夜，充分浸透至膜上沒有白色斑痕。 3．點樣：將充分浸透的膜條取出，用濾紙吸去多余的緩沖液，吸取少量血清滴于玻片上，用X光片或加樣器的鋼口蘸取血清，平直印在點樣線上，待血清完全浸入薄膜后移開。另點樣一條膜條，吸取少量已純化的γ球蛋白溶液滴于玻片上，其它操作同上述血清點樣。注意點樣位置與血清薄膜一致，以便比較遷移率。 4．電泳：將點樣膜條置于電泳槽上，使點樣面向下，點樣端置于陰極，槽架上用四層濾紙或兩層紗布作橋架，膜條與濾紙需貼緊，平衡約5分鐘后接通電源，調節(jié)電壓100110V，通電5060分鐘后關閉電源停止電泳。 5．染色：用鑷子將電泳后的膜條取出，浸于盛有氨基黑10B 的染色液中，染色5分鐘取出，先用蒸餾水沖一下，立即按順序浸入不同杯的漂洗液中漂洗45次，直至薄膜背景漂凈為止，用濾紙吸干薄膜。對照觀察血清薄膜與γ球蛋白薄膜兩者的電泳區(qū)帶分析結果。血清γ球蛋白分離、純化及鑒定操作流程 混勻，放置10分鐘 3000轉/分 離心10分鐘 鹽析 沉淀（球蛋白），加1ml水溶解 上清液為清蛋白部分，棄去 脫鹽 上葡聚糖凝膠柱 、收集含蛋白質部分 純化 上DEAE纖維素柱 、收集含蛋白質部分 濃縮 用葡聚糖凝膠G25干膠濃縮 鑒定 用醋酸纖維素薄膜電泳鑒定 [注意事項] 1．由于醋酸銨是揮發(fā)性鹽類，故溶液配置時不得加熱，配好后必須密封保存，以防pH及濃度發(fā)生改變，否則會影響所分離蛋白質純度。 ，時間不宜過長，否則DEAE纖維素會發(fā)生變質。 [試劑] 1. （pH ）：，加蒸餾水約800ml溶解，（用稀氨水或稀乙酸），再加蒸餾水定容至1000ml。 2. （pH ）：取1液用蒸餾水稀釋15 倍。 3. ：稱取NaCl ，()中定容至1000ml。 4. 飽和硫酸銨溶液：稱取固體硫酸銨850g，加入1000ml蒸餾水中，在7080oC攪拌促溶，室溫放置過夜，瓶底析出白色結晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。 5. 200g/L磺基水楊酸 6. 50g/L 醋酸鋇： HAc + Ba(OH)2 + 蒸餾水至100ml。 8. 9. ：,巴比妥， 用蒸餾水加熱溶解后，再加蒸餾水至1000ml。 10．氨基黑10B染液：稱取氨基黑10B 溶解于50ml甲醇中，再加冰醋酸10ml及蒸餾水40ml。 11．漂洗液：量取95%乙醇45ml，加冰醋酸5ml，蒸餾水50ml混勻。 12．葡聚糖凝膠G25 (SephadexG25)。 纖維素。 14．正常血清。 （周曉慧）實驗十二 動物肝組織中核酸的提取和鑒定[原理]動物組織中的核糖核酸（RNA）與脫氧核糖核酸（DNA）大部分與蛋白質結合形成核蛋白。肝組織中的核蛋白可用水提取，再用酚破壞核酸與蛋白質之間的結合鍵，并用乙醚抽提除去蛋白質及其它雜質，最后用乙醇將核酸沉淀。核酸（RNA，DNA）可被硫酸水解產生磷酸、有機堿（嘌呤和嘧啶）及戊糖（核糖或脫氧核糖）。此三類化合物可用下列方法鑒定：磷酸 能與鉬酸試劑作用生成磷鉬酸，后者在還原劑的作用下還原形成鉬藍，常用的還原劑有氨基苯磺酸、氯化亞錫、維生素C等。H3PO4+12H2MoO4 H3PO412MoO3 +12H2O 鉬酸 磷鉬酸還原劑H3PO412MoO3 H3PO46MoO33Mo2O5 鉬藍嘌呤堿 能與苦味酸作用形成針狀結晶。核糖 經與強酸（鹽酸或硫酸）共熱生成糠醛，后者與3，5二羥甲苯（5甲基1，3苯二酚，苔黑酚orcinol）反應，縮合而成綠色化合物。脫氧核糖 在強酸中加熱可生成ω羥基γ酮基戊醛，后者與二苯胺作用生成藍色化合物。[操作]（一） 動物肝組織中核酸的提取1．將兩只小白鼠處死，剖腹取出肝臟，用清水除去血液后置于研缽中（或用兔肝25g）加入凈砂少許，研磨至糊狀，再加蒸餾水3ml繼續(xù)研磨3分鐘。1． 再加入90%苯酚5ml，研磨10分鐘后倒入一圓底離心管中，離心5分鐘（約250r/min）。 3．將上層液體移于另一圓底離心管中，加乙醚2ml，管口覆蓋聚乙烯薄膜后用拇指將管口按住，用力振搖1－2分鐘（或用玻璃棒攪拌）。離心5分鐘后吸取全部下層液體于另一圓底離心管中。4．于該管中加入95%乙醇2ml，并用玻璃棒攪拌約2分鐘，離心3分鐘后傾去上清液，沉淀即為核酸。（二）核酸的水解　在核酸沉淀管內加入5％硫酸4ml搖勻，置沸水浴中加熱15分鐘，即得核酸水解液。用流水冷卻后進行下列定性實驗。（三）核酸組分的定性鑒定1．磷酸的鑒定：取試管2支，編號，按下表加入試劑，搖勻，于沸水浴中2－3分鐘，觀察兩管顏色之變化。試劑（滴）測定管（U）對照管（B）核酸水解液5%硫酸鉬酸試劑4%維生素C10－54－10542．嘌呤堿的鑒定：取試管１支，加入飽和苦味酸約2ml，再加入核酸水解液4－6滴，搖勻，靜置于室溫中，觀察有無黃色針狀結晶出現。3．核糖的鑒定：取試管兩支，編號，按下表操作。試劑（滴）測定管（U）對照管（B）核酸水解液5%硫酸拜耳氏試劑6－9－69搖勻，于沸水浴中加熱5分鐘后，觀察兩管顏色的變化。4．脫氧核糖的鑒定：取試管兩支，編號，按下表操作。試劑（滴）測定管（U）對照管（B）核酸水解液5%硫酸二苯胺試劑20－40－2040搖勻，于沸水浴中加熱10分鐘，觀察兩管顏色的變化。[注意事項]1．在制備肝勻漿時要充分研磨，破壞肝組織。2．肝組織可取自小鼠、家兔或豬肝，但以兔肝效果較好。以2公斤家兔計，兔肝重70g左右，每實驗室僅需1只家兔。3．實驗中使用乙醚、乙醇等易燃溶劑，又要使用沸水浴，如用明火加熱者應注意防火，以防發(fā)生事故。[試劑]1．90%苯酚溶液。2．乙醚。3．95%乙醇。4．5%硫酸。5．4%維生素C溶液（已氧化變質的維生素C不能用）。6．鉬酸試劑：鉬酸銨5g溶于100ml蒸餾水中，再加入濃硫酸15ml。冷卻后加蒸餾水至1000ml，冷處保存（一個月內不變質）。7．飽和苦味酸溶液 ，溶于100ml蒸餾水中，靜置過夜。臨用前取上清液。8．拜耳（Bial）氏試劑 ，5二羥甲苯，加入濃鹽酸500ml，再加10%氯化高鐵20至30滴。臨用前配制，冰箱保存。9．二苯胺試劑 取二苯胺1g溶于100ml冰乙酸（.）。臨用前配制，儲于棕色瓶中。（王魯華）實驗十三 動物組織中DNA的提取[原理]動物組織中的基因DNA均以脫氧核糖核蛋白的形式存在。在濃氯化鈉（1～2mol/L）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很大，而核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化鈉（）溶液中，脫氧核糖核蛋白的溶解度很小，而核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同濃度的氯化鈉溶液，將脫氧核糖核蛋白和核糖核蛋白從樣品中分別抽提出來。將抽提得到的脫氧核糖核蛋白用SDS處理，使DNA與蛋白質分開，再用氯仿異丙醇將蛋白質沉淀除去，而DNA溶于上層水相中，加入適量的95%乙醇，DNA鈉鹽即沉淀析出。為防止DNA酶解，提取時應加入EDTA二鈉（乙二胺四乙酸）。得到的樣品中DNA含量可用二苯胺法定量測定。DNA分子中的脫氧核糖基，在酸性溶液中轉變成ω羥基γ酮基戊醛，與二苯胺試劑作用生成藍色化合物，可用比色法測定。[操作] ：（1）將10只小白鼠迅速殺死，取出肝臟，剪碎，加入50ml ，置于勻漿器中研磨，待成糊狀后，將糊狀物離心10分鐘（4000r/min）棄去上清液。即重復加入50ml ，攪勻，離心。所得沉淀為脫氧核糖核蛋白粗制品。（2），使總體積為44ml，然后滴加25% SDS溶液3ml，邊加邊攪拌。加畢，置60oC水浴中保溫10分鐘（不停攪拌），溶液變得粘稠并且略透明，取出冷至室溫。此步驟使核酸與蛋白質分離。 （3）加入5mol/L NaCl溶液10ml，使NaCl最終濃度為1mol/L，攪拌10分鐘，加入約一倍體積氯仿異丙醇混合液，振搖20分鐘，離心10分鐘（4000r/min）。沉淀與下層液棄去，%乙醇，邊加邊用玻棒攪拌，DNA絲狀物即纏在玻棒上。 （4）將DNA粗品置于27ml ，再加入3ml ，攪勻。待絲狀DNA重新溶解后，加入一倍體積氯仿異丙醇混合液，振搖10分鐘，離心（4000r/min）10分鐘。可用氯仿異丙醇反復抽提，直至界面處不再出現蛋白質凝膠為止。%乙醇，邊加邊攪拌，DNA絲狀物即纏在玻棒上。 （5）取出絲狀DNA，依次用80%、95%及無水乙醇各洗一次，真空干燥。留待定量測定。2．鑒定 （1）標準曲線的繪制：取干試管6支，編號，按下表加入試劑：試 劑（ml）012345DNA標準液（50μg/ml）0二苯胺試劑混勻，60oC恒溫水浴中放置1小時。冷卻后，于600nm波長處進行比色。以各管光密度為縱坐標，DNA含量為橫坐標作圖。 （2）樣液測定：稱取干燥的樣品DNA 5mg溶于5ml 5mmol/L NaCl 溶液中，再按標準DNA溶液同法處理。然后，，置60oC恒溫水浴1小時，測定光密度。對照標準曲線求得DNA量。[結果與計算]按下式計算樣品中DNA的百分含量：[注意事項]1．本實驗也可用新鮮兔肝10g進行DNA的提取，本法提取的DNA已有一定程度的解聚。2．其它糖及糖的衍生物、芳香醛、羥基醛和蛋白質等，對二苯胺顯色反應有干擾，測定前應盡量除去。3．樣液中DNA含量應控制在50μg/ml左右。4．如無勻漿器，可用研缽研磨破碎組織。[試劑]1．5 mol/L NaCl溶液： NaCl溶于蒸餾水，稀釋至100ml。2． ： EDTA二鈉于蒸餾水，稀釋至1000ml。3．25% SDS溶液：溶25g十二烷基硫酸鈉于100ml 45% 乙醇。4．氯仿異丙醇混合液：氯仿：異丙醇=24﹕1（V/V）5．：，稀釋至100ml。6．：取10ml試劑5，稀釋至1000ml。7．80%乙醇。8．95%乙醇。9．無水乙醇。10．二苯胺試劑：A液：二苯胺（如不純，需在10%乙醇中重結晶2次），溶于100ml冰乙酸（A．R．），貯于棕色瓶。B液：，隨用隨配。臨用時，將20ml B液混合即得。11．1mol/L過氯酸溶液：將10ml 過氯酸（70%）用蒸餾水稀釋至110ml。12．：取50ml 1mol/L過氯酸，用蒸餾水稀釋至100ml。13．5mmol/L NaOH溶液：NaOH ，稀釋至100ml。14．標準DNA母液：準確稱取DNA5mg，溶于5ml 5mmol/L NaOH溶液中。4oC可保存6個月。15．標準DNA溶液：，70oC保溫10分鐘，冷卻，離心（4000r/min），，即得50μg/ml DNA標準溶液。（王魯華）實驗十四 動物組織中核酸含量的測定核酸分子中含有戊糖、磷酸和含氮堿。一般測定核酸的方法，是測定三者中的任何一種成分即可計算核酸的含量。下面分別介紹測磷法、測糖法和紫外吸收