【文章內容簡介】 文）3六、操作更簡便。液體菌種整個生產過程都是在一個罐體內完成，按鍵操作，既成倍降低了生產、管理費用，又節(jié)省人工，輕松制種。七、出菇整齊上市早。采用液體菌種的產品可以早上市 2 個月以上，早上市與晚上市在效益上差的可就大了。此外，采用液體菌種的栽培袋菌齡短，出菇整齊一致，適合出口要求，在價格上占優(yōu)勢。 國外杏鮑菇液體菌種研究現狀20 世紀中期，微生物液體深層培養(yǎng)（發(fā)酵）技術迅猛發(fā)展，從而形成了現代醫(yī)學、食品發(fā)酵工業(yè)。1948 年美國科學家 Humfeld 等成功地對蘑菇進行了液體深層培養(yǎng)，從而揭開了人類進行食用菌液體培養(yǎng)和液體菌種研究的序幕，并很快使歐美國家蘑菇生產在五、六十年代快步進入了液體菌種和工業(yè)化栽培時代 [9]。近年來，日本韓國等亞洲國家對香菇、金針菇、平菇液體菌種的研究應用已經很深入，已有許多菇廠開始用中小型發(fā)酵罐生產液體菌種進行栽培。 國內杏鮑菇液體菌種研究現狀我國較早從事食用菌液體深層發(fā)酵研究的是上海植物生理研究所孫美聿等人。1979 年上海師院的楊慶堯教授開始對香菇、金針菇等培養(yǎng)液體菌種，并進行栽培試驗。自 80 年代至 20 世紀來，我國許多科研院所的專家教授前輩開始對食用菌深層發(fā)酵、液體菌種及中小型發(fā)酵設備進行了反復、深入和刻苦的研究， 為今天我國液體菌種的社會化推廣應用，不論在發(fā)酵設備、工藝技術還是在栽培應用上，都提供了寶貴的經驗，奠定了堅實的基礎 [10]。目前已見的液體菌種生產與應用的食用菌品種，包括平菇、香菇、黑木耳、雙孢菇等常規(guī)品種和白靈菇、杏鮑菇、真姬菇等珍稀品種約五十多個品種 [11]。但對于液體菌種存在的保存期短，易失活，易污染，不便運輸等問題，還未見提出有效的解決辦法。雖然有資料表示液體菌種在 04℃保存 2—3 個月仍可作菌種，但也有試驗顯示液體菌種 04℃保存超過 3 天，菌種的生活力就有所下降，萌發(fā)慢，菌袋易污染。 杏鮑菇液體菌種生產中存在的問題液體菌種雖然在栽培上具有許多優(yōu)點，但目前仍不能取代固體菌種推廣使用，原因主要有以下幾方面 [14]：杏鮑菇液體菌種最佳培養(yǎng)周期的研究41．生產液體菌種的投入比較大。液體菌種生產設備投資大，一家一戶小規(guī)模生產，購買設備不劃算；培養(yǎng)設備需要有電源，而偏遠農村常常停電；液體菌種需要良好的培養(yǎng)環(huán)境，刨造良好的環(huán)境也需要較高的投入。2．液體菌種生產技術要求較高，需要專業(yè)的技術人員管理，才能保證菌種不受污染。一些小型食用菌生產廠家和一般菇農很難生產出優(yōu)質的液體菌種應用于生產。3．液體菌種菌絲球懸浮于液體培養(yǎng)基中，營養(yǎng)易于吸收，菌絲生長快，老化也快，液體菌種一旦生產出來應該及早使用，在接種時間上缺乏周轉余地，一次性投資大。因此，目前我國液體菌種只在個別大規(guī)模、工廠化的食用菌生產單位使用，而我國目前食用菌生產的現狀是分散的、小規(guī)模的副業(yè)式生產占據主體，因此科研和生產仍存在著差距，以致成果無法推廣。 研究目的與意義杏鮑菇的栽培，是以收獲子實體為目的的，并通過市場渠道而獲得經濟效益，菌種雖然不是最終目的，但是重要的中間手段。對杏鮑菇的菌種進行液體培養(yǎng)，單位體積液體培養(yǎng)基中生產菌絲速度快，生產量大，只需 4—5 天即可生產幾升到幾十升甚至更多。生產的液體菌種可以用作栽培用的母種或原種，也可直接作栽培種。液體菌種在固體培養(yǎng)基上萌發(fā)快、定植早、成品率高。據報道，把杏鮑菇的液體菌種接到固體培養(yǎng)料中，由于液體菌種具有流動性，因而接入的菌種可流散在不同的部位萌發(fā)生長 [15]。但是液體菌種質量是影響萌發(fā)出菇的關鍵因素之一，采用質量好的菌種無疑能提高出菇產量。液體菌種培養(yǎng)時間短則菌種活力不足，培養(yǎng)時間長則菌種老化，所以確定適宜的培養(yǎng)周期非常關鍵。2 試驗材料與方法 試驗材料 供試菌種杏鮑菇菌株，由河南科技大學提供。河南科技大學畢業(yè)設計（論文）5 設備儀器電熱鼓風干燥箱， 霉菌培養(yǎng)箱，立式電，熱壓力蒸汽滅菌器， 雙數顯汽浴恒溫振蕩器，離心機，分光光度計。 所需藥品葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，維生素 b，蒸餾水, 醋酸，醋酸鈉，羧甲基纖維素鈉，可溶性淀粉，酒石酸鉀鈉，3，5二硝基水楊酸，苯酚，氫氧化鈉，磷酸氫鉀，鄰聯甲苯胺，鄰苯二酚等。 實驗用具80 目篩網，電磁爐，250ml 三角瓶，試管，燒杯，吸管，培養(yǎng)皿，玻璃棒，量筒，溫度計，試管架，100ml 容量瓶，500ml 容量瓶，比色皿等。 試驗試劑及配制%可溶性淀粉溶液（、） ；%的羧甲基纖維素鈉溶液（用 ph=、） ；，ph=的磷酸鹽緩沖液；，ph= 的醋酸緩沖液。試管培養(yǎng)基：采用 PDA 培養(yǎng)基，馬鈴薯 200 克，葡萄糖 20 克，瓊脂 15 克，自來水 1000 毫升，自然 pH。配制方法：現將馬鈴薯洗凈去皮，再稱取 200g 馬鈴薯切成小塊，加水煮爛。用四層紗布過濾，加熱，再據實際實驗需要加瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂融完后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補足水分至 1000 毫升，分裝試管，加塞，包扎，滅菌 20 分鐘取出，試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆?。試驗培養(yǎng)基：采用黃豆粉培養(yǎng)基 [16]，黃豆粉 30g，葡萄糖 15g，蛋白胨 1g, 磷酸二氫鉀 ，硫酸鎂 ，維生素 b 5mg，水 500ml。配制方法如下：將黃豆粉加水煮沸 30min 后，用 80 目的篩網過濾，取其濾液，加入其他成分，補足水分，分裝在 250ml 的三角瓶中， 121℃濕熱滅菌 30min。一級菌種的制備：母種活化將保存的菌種轉接到無菌的斜面培養(yǎng)基上，放入25℃左右恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 7—10 天，得到斜面母種。取 左右的母種菌塊接種于裝有 150ml 一級培養(yǎng)基的 250ml 三角瓶中，每瓶 3 塊，25℃下靜置 2 天，然后在溫度 25℃、轉速 150r/min，振蕩培養(yǎng) 5 天 [17]。一級搖瓶培養(yǎng)基：葡萄糖30g，蛋白胨2g，瓊脂4g，硫酸杏鮑菇液體菌種最佳培養(yǎng)周期的研究6，VBl10mg，水1000ml，121℃滅菌20分鐘 [18]。二級菌種的制備：將一級菌種按試驗要求接種于裝有二級培養(yǎng)基的250ml 三角瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)，溫度25℃、轉速120r／min。DNS 試劑配制 ：酒石酸鉀鈉 ，溶于 50ml 蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入 3，5二硝基水楊酸 ，苯酚 ，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至 100ml，貯于棕色瓶中，室溫保存。但是一定要注意，3，5二硝基水楊酸和 NaOH 的加入時間一定要很近，或者是先加入 NaOH。否則會產生難溶的沉淀，導致配制溶液失敗。且配置過程中，溶液加熱溫度不宜超過 50℃。 測定方法 菌球直徑的測定取 lml 培養(yǎng)液放入培養(yǎng)皿中，按 lml 培養(yǎng)液含菌球大小的數量比，取 20 個菌球在培養(yǎng)皿中排成一列，測總長度，然后計算單個菌球直徑，取 3 次求平均值[19]。曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標，菌球直徑（mm）為縱坐標，繪制曲線。 菌球密度的測定將培養(yǎng)好的液體菌種搖勻后，取lml培養(yǎng)液于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿下墊方格紙直觀計數，取3次求平均值。曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標，菌球密度（個）為縱坐標，繪制曲線。 淀粉酶活性的測定在試管加入 %可溶性淀粉溶液（、），再加入稀釋 10 倍粗酶液 ，混勻，于 38℃水浴保溫 30min，取出后立即加入 DNS 試劑 ，煮沸 5min 后取出，冷卻后加入蒸餾水 ，混勻，測 520nm 處 OD 值，以煮沸滅活 15min 的酶液作對照 [20]（設置三個重復） 。曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標，淀粉酶活性 OD 值為縱坐標，繪制曲線。河南科技大學畢業(yè)設計（論文）7 羧甲基纖維素酶（CMC 酶）活性的測定在試管中加入 %的羧甲基纖維素鈉溶液（用 ph=、緩沖液配制），加稀釋 10 倍的粗酶液 ，50℃水浴保濕 10min，取出后立即加入 DNS 試劑 ，煮沸 5min，取出，冷卻后加入蒸餾水 ，混勻，測 520nm 處的 OD 值，以煮沸滅活 15min 的酶液作對照（設置三個重復） 。曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標，羧甲基纖維素酶（CMC 酶）活性OD 值為縱坐標，繪制曲線。 多酚氧化物酶活性測定先往試管中加入 ，ph= 的磷酸鹽緩沖液 ，再加入，再加稀釋 10 倍的粗酶液 ，28℃保溫 30min，測 400nm 處 OD 值，以煮沸滅活 15min 的酶液作對照（設置三個重復） 。曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標，多酚氧化物酶 OD 值為縱坐標，繪制曲線。 漆酶活性的測定先往試管中加入 ，ph= 的醋酸緩沖液 ，再加入 的鄰聯甲苯胺 ，再加入稀釋 10 倍的粗酶液 ，保溫 30min，測 600nm處光密度（OD 值） ，以煮沸滅活 15min 的酶液作對照（設置三個重復） 。曲線的繪制：以培養(yǎng)時間（天）為橫坐標，漆酶 OD 值為縱坐標，繪制曲線。 培養(yǎng)基 pH 的測定用玻璃棒蘸取少量培養(yǎng)基浸濕精密 pH 試紙，與標準比色卡對比讀數。 （設置