【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 文）3六、操作更簡(jiǎn)便。液體菌種整個(gè)生產(chǎn)過程都是在一個(gè)罐體內(nèi)完成，按鍵操作，既成倍降低了生產(chǎn)、管理費(fèi)用，又節(jié)省人工，輕松制種。七、出菇整齊上市早。采用液體菌種的產(chǎn)品可以早上市 2 個(gè)月以上，早上市與晚上市在效益上差的可就大了。此外，采用液體菌種的栽培袋菌齡短，出菇整齊一致，適合出口要求，在價(jià)格上占優(yōu)勢(shì)。 國(guó)外杏鮑菇液體菌種研究現(xiàn)狀20 世紀(jì)中期，微生物液體深層培養(yǎng)（發(fā)酵）技術(shù)迅猛發(fā)展，從而形成了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、食品發(fā)酵工業(yè)。1948 年美國(guó)科學(xué)家 Humfeld 等成功地對(duì)蘑菇進(jìn)行了液體深層培養(yǎng)，從而揭開了人類進(jìn)行食用菌液體培養(yǎng)和液體菌種研究的序幕，并很快使歐美國(guó)家蘑菇生產(chǎn)在五、六十年代快步進(jìn)入了液體菌種和工業(yè)化栽培時(shí)代 [9]。近年來，日本韓國(guó)等亞洲國(guó)家對(duì)香菇、金針菇、平菇液體菌種的研究應(yīng)用已經(jīng)很深入，已有許多菇廠開始用中小型發(fā)酵罐生產(chǎn)液體菌種進(jìn)行栽培。 國(guó)內(nèi)杏鮑菇液體菌種研究現(xiàn)狀我國(guó)較早從事食用菌液體深層發(fā)酵研究的是上海植物生理研究所孫美聿等人。1979 年上海師院的楊慶堯教授開始對(duì)香菇、金針菇等培養(yǎng)液體菌種，并進(jìn)行栽培試驗(yàn)。自 80 年代至 20 世紀(jì)來，我國(guó)許多科研院所的專家教授前輩開始對(duì)食用菌深層發(fā)酵、液體菌種及中小型發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行了反復(fù)、深入和刻苦的研究， 為今天我國(guó)液體菌種的社會(huì)化推廣應(yīng)用，不論在發(fā)酵設(shè)備、工藝技術(shù)還是在栽培應(yīng)用上，都提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)，奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ) [10]。目前已見的液體菌種生產(chǎn)與應(yīng)用的食用菌品種，包括平菇、香菇、黑木耳、雙孢菇等常規(guī)品種和白靈菇、杏鮑菇、真姬菇等珍稀品種約五十多個(gè)品種 [11]。但對(duì)于液體菌種存在的保存期短，易失活，易污染，不便運(yùn)輸?shù)葐栴}，還未見提出有效的解決辦法。雖然有資料表示液體菌種在 04℃保存 2—3 個(gè)月仍可作菌種，但也有試驗(yàn)顯示液體菌種 04℃保存超過 3 天，菌種的生活力就有所下降，萌發(fā)慢，菌袋易污染。 杏鮑菇液體菌種生產(chǎn)中存在的問題液體菌種雖然在栽培上具有許多優(yōu)點(diǎn)，但目前仍不能取代固體菌種推廣使用，原因主要有以下幾方面 [14]：杏鮑菇液體菌種最佳培養(yǎng)周期的研究41．生產(chǎn)液體菌種的投入比較大。液體菌種生產(chǎn)設(shè)備投資大，一家一戶小規(guī)模生產(chǎn)，購(gòu)買設(shè)備不劃算；培養(yǎng)設(shè)備需要有電源，而偏遠(yuǎn)農(nóng)村常常停電；液體菌種需要良好的培養(yǎng)環(huán)境，刨造良好的環(huán)境也需要較高的投入。2．液體菌種生產(chǎn)技術(shù)要求較高，需要專業(yè)的技術(shù)人員管理，才能保證菌種不受污染。一些小型食用菌生產(chǎn)廠家和一般菇農(nóng)很難生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的液體菌種應(yīng)用于生產(chǎn)。3．液體菌種菌絲球懸浮于液體培養(yǎng)基中，營(yíng)養(yǎng)易于吸收，菌絲生長(zhǎng)快，老化也快，液體菌種一旦生產(chǎn)出來應(yīng)該及早使用，在接種時(shí)間上缺乏周轉(zhuǎn)余地，一次性投資大。因此，目前我國(guó)液體菌種只在個(gè)別大規(guī)模、工廠化的食用菌生產(chǎn)單位使用，而我國(guó)目前食用菌生產(chǎn)的現(xiàn)狀是分散的、小規(guī)模的副業(yè)式生產(chǎn)占據(jù)主體，因此科研和生產(chǎn)仍存在著差距，以致成果無(wú)法推廣。 研究目的與意義杏鮑菇的栽培，是以收獲子實(shí)體為目的的，并通過市場(chǎng)渠道而獲得經(jīng)濟(jì)效益，菌種雖然不是最終目的，但是重要的中間手段。對(duì)杏鮑菇的菌種進(jìn)行液體培養(yǎng)，單位體積液體培養(yǎng)基中生產(chǎn)菌絲速度快，生產(chǎn)量大，只需 4—5 天即可生產(chǎn)幾升到幾十升甚至更多。生產(chǎn)的液體菌種可以用作栽培用的母種或原種，也可直接作栽培種。液體菌種在固體培養(yǎng)基上萌發(fā)快、定植早、成品率高。據(jù)報(bào)道，把杏鮑菇的液體菌種接到固體培養(yǎng)料中，由于液體菌種具有流動(dòng)性，因而接入的菌種可流散在不同的部位萌發(fā)生長(zhǎng) [15]。但是液體菌種質(zhì)量是影響萌發(fā)出菇的關(guān)鍵因素之一，采用質(zhì)量好的菌種無(wú)疑能提高出菇產(chǎn)量。液體菌種培養(yǎng)時(shí)間短則菌種活力不足，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)則菌種老化，所以確定適宜的培養(yǎng)周期非常關(guān)鍵。2 試驗(yàn)材料與方法 試驗(yàn)材料 供試菌種杏鮑菇菌株，由河南科技大學(xué)提供。河南科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）5 設(shè)備儀器電熱鼓風(fēng)干燥箱， 霉菌培養(yǎng)箱，立式電，熱壓力蒸汽滅菌器， 雙數(shù)顯汽浴恒溫振蕩器，離心機(jī)，分光光度計(jì)。 所需藥品葡萄糖，蛋白胨，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，維生素 b，蒸餾水, 醋酸，醋酸鈉，羧甲基纖維素鈉，可溶性淀粉，酒石酸鉀鈉，3，5二硝基水楊酸，苯酚，氫氧化鈉，磷酸氫鉀，鄰聯(lián)甲苯胺，鄰苯二酚等。 實(shí)驗(yàn)用具80 目篩網(wǎng)，電磁爐，250ml 三角瓶，試管，燒杯，吸管，培養(yǎng)皿，玻璃棒，量筒，溫度計(jì)，試管架，100ml 容量瓶，500ml 容量瓶，比色皿等。 試驗(yàn)試劑及配制%可溶性淀粉溶液（、） ；%的羧甲基纖維素鈉溶液（用 ph=、） ；，ph=的磷酸鹽緩沖液；，ph= 的醋酸緩沖液。試管培養(yǎng)基：采用 PDA 培養(yǎng)基，馬鈴薯 200 克，葡萄糖 20 克，瓊脂 15 克，自來水 1000 毫升，自然 pH。配制方法：現(xiàn)將馬鈴薯洗凈去皮，再稱取 200g 馬鈴薯切成小塊，加水煮爛。用四層紗布過濾，加熱，再據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要加瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂融完后，加入葡萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至 1000 毫升，分裝試管，加塞，包扎，滅菌 20 分鐘取出，試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆?。試?yàn)培養(yǎng)基：采用黃豆粉培養(yǎng)基 [16]，黃豆粉 30g，葡萄糖 15g，蛋白胨 1g, 磷酸二氫鉀 ，硫酸鎂 ，維生素 b 5mg，水 500ml。配制方法如下：將黃豆粉加水煮沸 30min 后，用 80 目的篩網(wǎng)過濾，取其濾液，加入其他成分，補(bǔ)足水分，分裝在 250ml 的三角瓶中， 121℃濕熱滅菌 30min。一級(jí)菌種的制備：母種活化將保存的菌種轉(zhuǎn)接到無(wú)菌的斜面培養(yǎng)基上，放入25℃左右恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 7—10 天，得到斜面母種。取 左右的母種菌塊接種于裝有 150ml 一級(jí)培養(yǎng)基的 250ml 三角瓶中，每瓶 3 塊，25℃下靜置 2 天，然后在溫度 25℃、轉(zhuǎn)速 150r/min，振蕩培養(yǎng) 5 天 [17]。一級(jí)搖瓶培養(yǎng)基：葡萄糖30g，蛋白胨2g，瓊脂4g，硫酸杏鮑菇液體菌種最佳培養(yǎng)周期的研究6，VBl10mg，水1000ml，121℃滅菌20分鐘 [18]。二級(jí)菌種的制備：將一級(jí)菌種按試驗(yàn)要求接種于裝有二級(jí)培養(yǎng)基的250ml 三角瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)，溫度25℃、轉(zhuǎn)速120r／min。DNS 試劑配制 ：酒石酸鉀鈉 ，溶于 50ml 蒸餾水中，加熱，于熱溶液中依次加入 3，5二硝基水楊酸 ，苯酚 ，攪拌至溶，冷卻后用蒸餾水定容至 100ml，貯于棕色瓶中，室溫保存。但是一定要注意，3，5二硝基水楊酸和 NaOH 的加入時(shí)間一定要很近，或者是先加入 NaOH。否則會(huì)產(chǎn)生難溶的沉淀，導(dǎo)致配制溶液失敗。且配置過程中，溶液加熱溫度不宜超過 50℃。 測(cè)定方法 菌球直徑的測(cè)定取 lml 培養(yǎng)液放入培養(yǎng)皿中，按 lml 培養(yǎng)液含菌球大小的數(shù)量比，取 20 個(gè)菌球在培養(yǎng)皿中排成一列，測(cè)總長(zhǎng)度，然后計(jì)算單個(gè)菌球直徑，取 3 次求平均值[19]。曲線的繪制：以培養(yǎng)時(shí)間（天）為橫坐標(biāo)，菌球直徑（mm）為縱坐標(biāo)，繪制曲線。 菌球密度的測(cè)定將培養(yǎng)好的液體菌種搖勻后，取lml培養(yǎng)液于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿下墊方格紙直觀計(jì)數(shù)，取3次求平均值。曲線的繪制：以培養(yǎng)時(shí)間（天）為橫坐標(biāo)，菌球密度（個(gè)）為縱坐標(biāo)，繪制曲線。 淀粉酶活性的測(cè)定在試管加入 %可溶性淀粉溶液（、），再加入稀釋 10 倍粗酶液 ，混勻，于 38℃水浴保溫 30min，取出后立即加入 DNS 試劑 ，煮沸 5min 后取出，冷卻后加入蒸餾水 ，混勻，測(cè) 520nm 處 OD 值，以煮沸滅活 15min 的酶液作對(duì)照 [20]（設(shè)置三個(gè)重復(fù)） 。曲線的繪制：以培養(yǎng)時(shí)間（天）為橫坐標(biāo)，淀粉酶活性 OD 值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。河南科技大學(xué)畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）7 羧甲基纖維素酶（CMC 酶）活性的測(cè)定在試管中加入 %的羧甲基纖維素鈉溶液（用 ph=、緩沖液配制），加稀釋 10 倍的粗酶液 ，50℃水浴保濕 10min，取出后立即加入 DNS 試劑 ，煮沸 5min，取出，冷卻后加入蒸餾水 ，混勻，測(cè) 520nm 處的 OD 值，以煮沸滅活 15min 的酶液作對(duì)照（設(shè)置三個(gè)重復(fù)） 。曲線的繪制：以培養(yǎng)時(shí)間（天）為橫坐標(biāo)，羧甲基纖維素酶（CMC 酶）活性O(shè)D 值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。 多酚氧化物酶活性測(cè)定先往試管中加入 ，ph= 的磷酸鹽緩沖液 ，再加入，再加稀釋 10 倍的粗酶液 ，28℃保溫 30min，測(cè) 400nm 處 OD 值，以煮沸滅活 15min 的酶液作對(duì)照（設(shè)置三個(gè)重復(fù)） 。曲線的繪制：以培養(yǎng)時(shí)間（天）為橫坐標(biāo)，多酚氧化物酶 OD 值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。 漆酶活性的測(cè)定先往試管中加入 ，ph= 的醋酸緩沖液 ，再加入 的鄰聯(lián)甲苯胺 ，再加入稀釋 10 倍的粗酶液 ，保溫 30min，測(cè) 600nm處光密度（OD 值） ，以煮沸滅活 15min 的酶液作對(duì)照（設(shè)置三個(gè)重復(fù)） 。曲線的繪制：以培養(yǎng)時(shí)間（天）為橫坐標(biāo)，漆酶 OD 值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。 培養(yǎng)基 pH 的測(cè)定用玻璃棒蘸取少量培養(yǎng)基浸濕精密 pH 試紙，與標(biāo)準(zhǔn)比色卡對(duì)比讀數(shù)。 （設(shè)置