【文章內(nèi)容簡介】 復(fù)性主要有兩種方式：1，稀釋溶液，但是操作的液體量大，蛋白稀釋2，透析，超濾或電滲透析去除變性劑其中透析很適合實驗室應(yīng)用，但是時間長。另外，如果蛋白質(zhì)右兩個以上的2硫鍵，很可能錯誤形成配對，應(yīng)用還原劑。還有，復(fù)性的具體方法還要根據(jù)前期試驗及篩選來確定！另外，你用多大體積的透析緩沖液？可能不夠，要更換幾次你家了多少蛋白呀？蛋白量過大也會使復(fù)性困難。你用的透析代是否是新的，處理過沒有？新代有化學(xué)雜質(zhì)！最后，有些復(fù)性過程就是還有沉淀（透析方法的缺點）看看溶液中蛋白含量，說不定已經(jīng)夠用了~~包涵體的復(fù)性還要注意以下幾點：，一般應(yīng)使溶解液體量較大，不要怕蛋白被稀釋，要有助溶措施。.。小技巧：1）包含體要徹底洗滌干凈，洗滌液中加入適量TritonX100.2)包含體溶解后裝入透析袋在復(fù)性液中復(fù)性3）復(fù)性液的組成很有講究，本人使用OxidisedGlutathione/ReducedGlutathione還加入一定的LArginineHydrochloride1224h4)復(fù)性完畢在低濃度的緩沖液中連續(xù)緩慢透析1224h5)復(fù)性率的測定據(jù)變性蛋白和非變性蛋白的光學(xué)性質(zhì)不同測定（望有經(jīng)驗的戰(zhàn)友能更詳細地講解）6）TritionX100、SDS這一類去垢劑最后不易去除，在制藥行業(yè)中一般不允許采用。%吧，忘了。我用Triton洗滌有些包涵體效果不是很好。包涵體洗滌是純化極為重要的一步，改變培養(yǎng)條件，再洗滌包涵體，有時可以在上柱前已經(jīng)只剩下34條雜帶，這樣后續(xù)的純化就很方便了。因為色譜柱的純化條件比較難optimize。這段文字可以參考：用Novagen公司《pETSystemManual》提供的方法，分別進行細菌滲透休克，超聲波裂解，研究融合蛋白在細胞周質(zhì)，細胞質(zhì)和包涵體中的分布。滲透休克（10ml體積），測菌液OD600，10000r/min去上清，加入滲透休克溶液1（V1=OD600V2/5，V1為滲透休克溶液1，V2為培養(yǎng)新鮮菌液），冰浴10min，10000r/min，去上清。加V1體積滲透休克溶液2重懸，搖動冰浴10min，10000r/min，保存上清、細菌沉淀。作如下處理：上清用三氯乙酸(TCATrichloroaceticacid)沉淀，加1/10體積100%TCA(w/v)，渦漩15sec.，冰浴10min，13000r/min離心5min，100ul丙酮洗滌沉淀，干燥1h，加V1/2體積1PBS（pH10）溶解，20℃保存，取10ul加入等體積2SB，進行12%SDSPAGE電泳分析，UNIUERSAL.75s成像系統(tǒng)照相。超聲波裂解細菌滲透休克細菌沉淀加1/10培養(yǎng)體積20mMTrisHCl（pH，0℃）重懸，冰浴，超聲波裂解，20%工作選擇，脈沖粉碎1min，然后13000r/min離心5min，20℃保存上清、細菌沉淀。上清進行TCA沉淀，處理同上。沉淀用ProteinExtractionReagent（NiNTAHiBindPurificationKitBugBuster.提供）按Novagen公司《pETSystemManual》提供方法反復(fù)處理，洗滌包涵體。包涵體按培養(yǎng)菌100OD600/3ul體積加1%SDS溶解，加等體積2SB，進行12%SDSPAGE電泳分析，進行蛋白條帶灰度掃描，計算融合蛋白TrxPrPC2730占細菌總蛋白的相對含量。PrPpET32a（+）BL21（DE3），TB培養(yǎng)基中，25℃，AMP200ug/ml，搖床（250r／min），更換等體積新鮮TB培養(yǎng)基，加入IPTG至終濃度1mM，AMP200ug/ml，25℃，4h，4000g離心收集菌體。按NiNTAHiBindPurificationKit使用說明溶解包涵體，純化融合蛋白?；蚴褂霉P者改進方法，將NiNTAHiBindPurificationKit使用說明中BufferD改成WashBuffer，BufferE改成EluteBuffer，最后用BufferE重生NiNTAHiBindRasin，BindingBuffer平衡以后加50%酒精保存，以免長菌。洗脫所得蛋白用TCA沉淀，處理同上，得融合蛋白TrxPrPC2730，凍干保存。然后12%SDSPAGE凝膠電泳分析。包涵體復(fù)性2精氨酸可助溶，但精氨酸是代謝產(chǎn)物高濃度對人可能不好。另外甘氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以試一試。對于疏水蛋白的可溶表達，可以降低誘導(dǎo)溫度（可以試試4度誘導(dǎo)過夜）和IPTG的量，降低蛋白的表達速度，從而減少包涵體形成的速度，增加正確折疊蛋白的量?；蛘邠Q成GST融合表達載體，GST可以增加后面融合蛋白的可溶表達。我的蛋白包涵體在經(jīng)變性純化后透析復(fù)性過程中，在透析液中加入了1%的甘氨酸和5%的甘油，有一定的助溶效果。我想對于你的情況，由于含有二硫鍵，還要加入一定比例的谷胱甘肽，才能形成正確的二硫鍵。復(fù)性是一個很難捉摸的過程，不同蛋白的復(fù)性條件也各不相同。包涵體復(fù)性問題包含體復(fù)性三大原則：1。低濃度2。平緩梯度3。低溫有蛋白析出最大的可能型是：蛋白濃度太高，建議你稀釋以后再作透析。此外，透析的鹽濃度（比如ura）要平緩降低：8m6m4m2mpbsH2O。包涵體復(fù)性形成聚集物關(guān)鍵是蛋白在復(fù)性過程中凝聚了以后，調(diào)節(jié)PH可以使其溶解，但是這樣復(fù)性好的蛋白有沒有活性還是問題，雖然樣品溶解了，但活性不高或沒有也不行呀！復(fù)性中蛋白析出！出現(xiàn)蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復(fù)性應(yīng)該采取復(fù)性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據(jù)你包含體的溶液成分，每隔1個PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。但是復(fù)性的比率應(yīng)該很低。若加變性劑尿素可加到2M，；另外可將甘油濃度增加，范圍可在≤30%，且在復(fù)性樣品中也可加適量甘油；一些拙見。包涵體復(fù)性液配方對于包涵體復(fù)性，一般在尿素濃度4M左右時復(fù)性過程開始，到2M左右時結(jié)束。對于鹽酸胍而言，可以從4M開始，時復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。TRIS系統(tǒng)和PBS系統(tǒng)都沒有明確的規(guī)定，這些需要你在實驗過程中不斷試驗，確定合適的緩沖系統(tǒng)；不過復(fù)性過程主要是注意以下幾個問題：1）；2)溫度適宜選擇4℃；3）復(fù)性過程蛋白濃度不宜過大，；4)復(fù)性時間一般為2436小時；5)低分子化合物如LArg有助于增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度；脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進劑，都可阻止蛋白聚集；Tris對蛋白質(zhì)復(fù)性有促進作用；EDTA可以防止蛋白降解；6)氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.。還有就是你的蛋白質(zhì)的特性什么叫復(fù)性成功復(fù)性效果的檢測：根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進行檢測。1，凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非