【文章內容簡介】 含有IgG的上清對PBS透析，然后分裝、置20℃保存。表1 沉淀不同來源IgG的辛酸參考用量IgG來源 辛酸用量（每10ml腹水或上清）小 鼠 400μl人 700μl羊 700μl兔 750μl質量檢察上清中IgG的純度可用SDSPAGE分析及合適的酶標免疫測試法測定其免疫活性來確定。上清中可能存在少量雜質，可通過DEAE離子交換層析除去。參考文獻1. Russo,C., Callegaro,L.,Lanza,E., and Ferrone,S. (1983) Purification of IgG monoclonal antibody by caprylic acid precipitation. J. Immunol. Meth. 65,2692712. Steianbuch,M. and Audran,R. (1969) The isolation of IgG from mammalian sera with the aid of caprylic acid. . 134, 279284（朱正美）　第五節(jié) Sephadex凝膠過濾純化抗體基本原理凝膠過濾又稱分子篩層析。是一種借助分子篩效應將分子大小不同的混合物進行分離的方法。交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex是常用的層析介質。它是一種含有許多網眼的球形小顆粒，網眼大小分布均一。當分子大小不同的混合物通過凝膠柱時，其中較大的分子不能進入凝膠網眼，將毫無阻力或阻力很小地隨洗脫液流出，而小分子物則能擴散進入網眼，被阻滯在層析柱上，分子量越小，擴散出來所耗時間就越長。因此分子大小不同的MoAb可以借助分子篩效應進行分離提純。本文以IgM的純化為例介紹此方法。IgM因分子特別大（900 kd）而不能進入凝膠顆粒的網孔，可首先被洗脫達到初步純化的目的。試劑和器材 Sephadex G 100 或G 200 粗制IgMMoAb培養(yǎng)物或抗血清，腹水等 洗脫緩沖液： 層析柱（ cm198。 180。 30 180。 40 cm） 透析袋 (MW CO 10 000) 磁力攪拌器 部分收集器 紫外檢測儀 離心機步驟 樣品處理：將腹水、抗血清或培養(yǎng)上清液離心4000180。g 20分鐘，以除去細胞碎片。較稠的腹水和血清需適當稀釋； 裝柱：根據樣品量選擇合適的層析柱，然后將漂洗溶漲的Sephadex G 100 或G 200 傾入柱中，自然沉降30分鐘， 再用同樣的緩沖液平衡柱1小時，； 儀器連接：將紫外檢測儀和部分收集器與層析柱連接； 上樣和洗脫：待柱上平衡緩沖溶液接近凝膠上表面時。當樣品液 面接近凝膠上表面時，加少量緩沖液清洗柱壁，然后接上緩沖液洗脫并收集12 ml/管。280nm 檢測的第一蛋白峰即為IgMMoAb。濃縮與保存：將280nm檢測的第一蛋白峰合并，移入透析袋在磁力攪拌器上4176。C對PBS流動透析過夜。透析后的溶液可經聚乙二醇或五氧化二磷真空干燥濃縮后，分裝封管，20176。C保存?zhèn)溆?。檢測可用SDSPAGE 或定量免疫學方法（RIA、ELISA）檢測各部分洗脫液的抗體。IgMMoAb一般在外水體積洗脫。應用提示凝膠過濾不變換洗脫液，一次裝柱后可反復使用多次。操作簡單，快速經濟。實驗可重復性高，樣品回收幾乎可達100%，且方法溫和，不易引起生物樣品變性失活，可進行大量樣品的分離純化。用于小分子物（如無機鹽）從大分子物（MW20 000）分離的層析柱，柱體積應大于樣品體積410倍，其高與直徑的比例應為5:115:1；用于大分子物之間的分離（如免疫球蛋白之間的分離），則柱體積應大于樣品體積25100倍，高與直徑的比例應為20:1100:1。Sephadex凝膠裝柱時，應灌制均勻無斷層和氣泡。在整個操作過程中，凝膠應始終保持在液面以下。提取的IgM濃度過低或反復凍融會引起變性，應分裝后在70176。C或20176。C凍存，176。C可保存數月。如無合用的部分收集器，可手工收集12ml/管，用分光光度計測定各管吸光度值。參考文獻 周本正編著 《層析技術及其應用》 湖北科學技術出版社（1992）2830 , , 主編 鄭昌學,吳安然等譯 《分子免疫學》 科學出版社 (1988) 212214第六節(jié) 免疫球蛋白G的親和層析純化法（蛋白A或蛋白G法）基本原理蛋白A是金黃色葡萄球菌的細胞壁(cell wall)(cell wall)成分。蛋白G是G組鏈球菌的細胞壁(cell wall)(cell wall)成分。這兩種蛋白質分子可通過免疫球蛋白的FC區(qū)和大多數哺乳動物(mammal。mammalian)(mammal。mammalian)的IgG結合(見表1)。利用基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)技術，將蛋白A和蛋白G分子中與Fc區(qū)結合的結構域部分的基因融合，所產生的融合蛋白，則具有更廣泛的IgG結合特異性。蛋白A、蛋白G或融合蛋白A/G與免疫球蛋白Fc段的結合性能使它成為可用于IgG分離的、天然的親和配基。將這些配基蛋白結合到固體支持物上，提供了應用親和層析純化抗體的一步法的基礎。試劑及儀器l 含IgG的樣品l PBS(見附錄)l 裝有2ml固相化的蛋白A、蛋白G或蛋白A/G的小型層析柱(有商品供應)l 透析袋(MWCO 10,000)l 結合緩沖液：+ l 分步收集器(可按需要選用)l 洗脫緩沖液:+l 中和緩沖液：1mol/L TrisHCl pH l 蠕動泵(可按需要選用)l UV監(jiān)測器l pH計操作步驟* 樣品(可為血清、腹水、含有IgG的單克隆和多克隆抗體的細胞上清液)。1． 樣品在4℃,對結合緩沖液透析過夜，或將其與至少1：1稀釋的結合緩沖液混合；2． 如果條件充許，將層析柱與蠕動泵、分步收集器和UV監(jiān)測器相連；3． 至少用10ml結合緩沖液, 以1ml/min速度, 洗滌柱中的2ml親和層析介質；4． 上樣；5． 一旦樣品進入凝膠，用結合緩沖液洗柱（至少10個柱體積），直至A280nm ；6． 用洗脫緩沖液洗脫所結合的IgG,分布收集2ml/管；7． 收集過程中,，以中和洗脫所得的IgG液。8． 含IgG的各管對PBS透析,其后根據抗體的穩(wěn)定性,加入防腐劑()，置4℃或冷凍保存。實驗要點及說明通常可通過SDSPAGE分析或通過適當的免疫方法 (如Western blot, ELISA等)，對洗脫組分進行純度鑒定和免疫活性測定。1. 上樣量由層析柱的對特定免疫球蛋白的容量確定，2ml柱對于小鼠IgG 的容量約10mg，對于人IgG的容量約為 18mg；2. 柱上結合的抗體被洗脫的速度很快, 通常在第一洗脫流份中；3. 下列緩沖液也可用為結合緩沖液：,。 高鹽結合緩沖液（1 mol/L NaCl）可能增加總的柱結合容量約50%；4. ，通常能增加蛋白A對小鼠IgG