單克隆抗體與基因工程抗體的制備(編輯修改稿)
2025-02-07 08:17 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 PcAb的比較 McAb and PcAb 第三節(jié) 基因工程抗體制備 基因工程抗體 (Geic engineering antibody) 根據(jù)研究者的意圖，采用基因工程方法，在基因水平，對免疫球蛋白基因進(jìn)行切割、拼接或修飾后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生新型抗體。主要包括嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、雙價(jià)抗體和雙特異性抗體。 將小鼠 Ig基因敲除，轉(zhuǎn)染人 Ig基因，在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生人 Ab，再經(jīng)雜交瘤技術(shù)，產(chǎn)生大量完全人源化抗體 一、人源化抗體 方法： 從雜交瘤細(xì)胞分離出功能性可變區(qū)基因，與人 Ig恒定區(qū)基因連接，插入適當(dāng)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，表達(dá)人鼠嵌合抗體 特點(diǎn)： 減少了鼠源性抗體的免疫原性 保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力 （一）嵌合抗體 嵌合抗體 定義： 指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（ V）中互補(bǔ)決定簇（ CDR）序列改換成鼠源單抗 CDR序列。重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。RAb亦叫“重構(gòu)型抗體”，因其主要涉及 CDR的“移植”，又可稱為“ CDR移植抗體 意義： 多種特異的鼠源單抗有可能應(yīng)用于臨床治療 （二）改型抗體 Fab： 抗原結(jié)合片斷 Fv： 可變區(qū)片段 ScFv： 單鏈可變區(qū)片段 SdAb： 單區(qū)抗體 二、小分子抗體 小分子抗體 其它生物活性蛋白融合 三、抗體融合蛋白 許多抗原抗體反應(yīng)要求雙價(jià)的抗原結(jié)合位點(diǎn)，使抗原分子上的兩個(gè)表位交聯(lián)或使兩個(gè)抗原分子連接。將識別腫瘤抗原的抗體和識別細(xì)胞毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞表面分子的抗體連結(jié)在一起，可使效應(yīng)細(xì)胞更容易與腫瘤細(xì)胞結(jié)合識別，取得殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。 四、雙特異性抗體 分別分離純化兩種不同的 McAb，使各抗體解離為單價(jià)抗體，再使兩種不同抗原特異性的單價(jià)抗體通過化學(xué)試劑交聯(lián)起來，然后分離出目的組分。此法缺點(diǎn)是容易導(dǎo)致抗體失去活性，產(chǎn)物均一性不佳。 化學(xué)交聯(lián) BsAb 將兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行再次融合，產(chǎn)生四源雜交瘤 (quadroma)。 但二次雜交瘤細(xì)胞株分泌的是兩套重鏈，輕鏈的隨機(jī)組合物。 BsAb在其中的比例可為 10%～ 50%不等。多倍雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性差，BsAb的產(chǎn)量少且活性低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，臨床應(yīng)用時(shí)存在人抗鼠抗體免疫反應(yīng) (HAMA)，因此不適用于臨床。 細(xì)胞工程 BsAb 多采用抗體分子片段 ,如 Fab，F(xiàn)v或 ScFv,經(jīng)基因操作修飾后 ,或體外組裝為 BsAb,或直接表達(dá)分泌型的 BsAb。 基因工程 BsAb 定義： 將體外克隆的抗體基因片段插入噬菌體載體，轉(zhuǎn)染工程細(xì)菌進(jìn)行表達(dá)，然后用抗原篩選即可獲得特異的單克隆噬菌體抗體。利用這一技術(shù)可以得到完全人源性的抗體，在 HIV等病毒感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨(dú)特的優(yōu)越性 五、噬菌體抗體庫技術(shù) 用 PCR擴(kuò)增人抗體重鏈可變區(qū) (VH)和輕鏈可變區(qū) (VL)基因 克隆到噬菌體載體并以融合蛋白的形式表達(dá)在其外殼表面 用抗原抗體反應(yīng)篩選出表達(dá)所需要抗體的克隆并擴(kuò)增。 使抗體基因以分泌的方式表達(dá)，獲得可溶性的抗體片段。 抗體庫： 組合抗體文庫：在建庫過程中如果將 VH和 VL隨機(jī)組合 人天然抗體庫：抗體 mRNA來源于未經(jīng)免疫的正常人 （一）基本原理和程序 噬菌體抗體庫 ① 從外周血或脾、淋巴結(jié)等組織中分離 B淋巴細(xì)胞，提取 mRNA并逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA； ② 應(yīng)用抗體輕鏈和重鏈引物，根據(jù)建庫的需要通過 PCR技術(shù)擴(kuò)增不同的 Ig基因片段； ③ 構(gòu)建噬菌體載體。噬菌體抗體庫載體有 λ 噬菌體、絲狀噬菌體和噬菌粒三種，其中后二者是目前構(gòu)建表面表達(dá)的噬菌體抗體庫 (surface display antibody library)常用載體； ④ 表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌，構(gòu)建全套抗體庫。通過多輪的抗原親合吸附 洗脫 擴(kuò)增，最終篩選出抗原特異的抗體克隆。 構(gòu)建噬菌體抗體庫 模擬天然全套抗體庫 抗體文庫可以達(dá)到或超過 1011庫容 ,能包含 B細(xì)胞全部克隆 建庫的外源基因來自人體多克隆細(xì)胞的總 mRNA 通用引物具有人的種屬普遍性 抗體的 VH和 VL基因的隨機(jī)重組也增加了抗體的多樣性 （二）噬菌體抗體庫技術(shù)的特點(diǎn) 避開了人工免疫和雜交瘤技術(shù) 抗體庫的大容量 抗體庫極高的篩選效率 可獲得
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