【正文】 有的蛋白。問題是由于SDS無法徹底的去除而不允許在制藥過程中使用。極端pH：可以破壞蛋白的次級(jí)鍵從而增溶蛋白。如有人在pH。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。變性劑的使用濃度和作用時(shí)間：，尿素在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定。有些蛋白只能用鹽酸胍如IL4。增溶時(shí)一般室溫過夜，但鹽酸胍在37度1小時(shí)便可以使多數(shù)蛋白完全變性溶解。還原劑：由于蛋白間二硫鍵的存在，在增溶時(shí)一般使用還原劑。還原劑的使用濃度一般是50100mM2BME或DTT，也有文獻(xiàn)使用5mM濃度。在較粗放的條件下，可以使用5ml/l的濃度。還原劑的使用濃度與蛋白二硫鍵的數(shù)目無關(guān)，而有些沒有二硫鍵的蛋白加不加還原劑無影響，如牛生長(zhǎng)激素包涵體的增溶。對(duì)于目標(biāo)蛋白沒有二硫鍵某些包涵體的增溶，有時(shí)還原劑的使用也是必要的，可能由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。復(fù)性：通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過程開始，到2M左右時(shí)結(jié)束。對(duì)于鹽酸胍而言，可以從4M開始，時(shí)復(fù)性過程已經(jīng)結(jié)束。復(fù)性中常采用的方法有：稀釋復(fù)性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點(diǎn)是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。透析復(fù)性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成沉淀，且不適合大規(guī)模操作，無法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模。超濾復(fù)性：在生產(chǎn)中較多的使用，規(guī)模較大，易于對(duì)透析速度進(jìn)行控制，缺點(diǎn)是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。柱上復(fù)性：是最近研究較多并成功的在生產(chǎn)中應(yīng)用的一種復(fù)性方法，如華北制藥的GCSF復(fù)性據(jù)說是通過柱上復(fù)性進(jìn)行的。常用于復(fù)性的層析方法有SEC、HIC等。還原劑的去除：還原劑一般和變性劑的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫鍵慢慢形成。但是由于二硫鍵的形成并不是蛋白質(zhì)正確折疊所必須的，可以考慮在變性劑完全去除之后，在去除還原劑使已經(jīng)按照正確的結(jié)構(gòu)相互接近的巰基間形成正確的二硫鍵。常用的氧化方法有：空氣氧化法：在堿性條件下通空氣，或者加入二價(jià)銅離子，能夠取得更好的效果，缺點(diǎn)是不易控制氧化還原電勢(shì)。氧化還原電對(duì)（redox）：常采用GSSG/GSH，通過調(diào)整兩者的比例來控制較精確的氧化還原電勢(shì)，也可以在添加了還原劑如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mMDTT=GSH/GSSG()。復(fù)性的效率：復(fù)性是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，除與蛋白質(zhì)復(fù)性的過程控制相關(guān)外，還很大程度上與蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，有些蛋白非常容易復(fù)性，如牛胰RNA酶有12對(duì)二硫鍵，在較寬松的條件下復(fù)性效率可以達(dá)到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行復(fù)性的方法如IL11，很多蛋白的復(fù)性效率只有百分之零點(diǎn)幾。一般說來，蛋白質(zhì)的復(fù)性效率在20%左右。影響復(fù)性效率的因素有蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢(shì)、離子強(qiáng)度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。復(fù)性過程的添加劑：共溶劑：如PEG600020000，據(jù)說可以可逆的修飾折疊中間體的疏水集團(tuán)，此外由于阻止了蛋白質(zhì)分子間的相互接觸的機(jī)會(huì)，也可能對(duì)復(fù)性效率的提高起作用。%左右，具體條件可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件確定。二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）和脯氨酸異構(gòu)酶（PPI）：PDI可以使錯(cuò)配的二硫鍵打開并重新組合，從而有利于恢復(fù)到正常的結(jié)構(gòu)，此外在復(fù)性過程中蛋白質(zhì)的脯氨酸兩種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)變需要較高能量，常常是復(fù)性過程中的限速步驟，而PPI的作用是促進(jìn)兩種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)復(fù)性的進(jìn)行。分子伴侶，即熱休克蛋白（HSP），是一種沒有蛋白質(zhì)特異性的促進(jìn)折疊的蛋白因子，研究發(fā)現(xiàn)很多蛋白在缺乏分子伴侶時(shí)無法自己正確的折疊。有人構(gòu)建了與伴侶分子共同表達(dá)的菌株，據(jù)說效果不錯(cuò)。不過在生產(chǎn)中還沒有看到2和3的應(yīng)用的例子。：成功的應(yīng)用于很多蛋白如tPA的復(fù)性中，可以抑制二聚體的形成。甘油等：增加黏度，減少分子碰撞機(jī)會(huì)，一般使用濃度在%530%。一定的鹽濃度，可能是為了降低某些帶電集團(tuán)間的斥力，有利于蛋白質(zhì)的折疊。輔助因子：添加蛋白質(zhì)活性狀態(tài)必須的輔助因子如輔酶輔基等或蛋白配體等很多時(shí)候?qū)Φ鞍踪|(zhì)正確的折疊是有利的。色譜法：通過將目標(biāo)蛋白結(jié)合到層析柱上，減少蛋白分子間的相互影響，該方法得到越來越多的應(yīng)用，常用的色譜有SEC、HIC、IEC、IMAC等。當(dāng)然，雖然有很多所謂的理性的復(fù)性方案設(shè)計(jì)，目前的復(fù)性工作更多的是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)的過程，沒有一種通用的方法可以套用。復(fù)性時(shí)的蛋白濃度：，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經(jīng)濟(jì)，而且很多蛋白在低濃度時(shí)不穩(wěn)定，很容易變性。復(fù)性效果的檢測(cè)：根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對(duì)蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測(cè)。凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測(cè)變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對(duì)情況。光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測(cè)，但一般只用于復(fù)性研究中的過程檢測(cè)。色譜方法：如IEX、RPHPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。生物學(xué)活性及比活測(cè)定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測(cè)定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測(cè)活方法測(cè)得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。黏度和濁度測(cè)定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。幾個(gè)復(fù)性的實(shí)例：MHCIIJBC269（47）：1994增溶：1640mgProtein,8MGdnHCl,1632mMDTT,1mMEDTA,50mMTris.復(fù)性：816folddilutionto15mg/mlProtein.增溶：10mMDTT,%SDS,25mMTris,200mMGlucine.復(fù)性：10倍稀釋到10mMDTT,2mMDodOMalt(dodecylbetaDmaltoside),150mMNaCl,10mMTris，開口透析8hr，對(duì)150mMNaCl,10mMTrisBovinePrethrombin2,JBC270(1):1990四對(duì)二硫鍵。增溶：7MGdnHCl,10mMTris,1mMEDTA4mg/ml.復(fù)性：稀釋到100mMNa2HPO4,2mMEDTA,%PEG,04MGdnHCl,mMGSSG,mMGSH,mg/ml25mMsodiumphosphate,2mMEDTA,%PEG,透析3次，溫度4度。純化：一般說來，復(fù)性液的體積較大，為了減少處理體積，在進(jìn)行柱純化以前可以先進(jìn)行硫酸銨沉淀，沉淀在低速離心收集后復(fù)溶的鹽濃度較高，可以直接進(jìn)行HIC純化，目標(biāo)峰經(jīng)適當(dāng)稀釋后（cond5mS/cm）進(jìn)行IEX純化，然后通過SEC脫鹽，更換緩沖液，除菌過濾后，在質(zhì)量合格的情況下便可以進(jìn)入制劑階段。當(dāng)然在復(fù)性濃度較高的情況下，也可以直接將復(fù)性液進(jìn)行IEX純化，優(yōu)點(diǎn)是在純化的同時(shí)進(jìn)行體積的濃縮，為以后的精制創(chuàng)造條件。從生產(chǎn)的角度看，由于每增加一步純化工序便降低很多收率，所以可過兩到三次柱純化，工藝越簡(jiǎn)單越有利于收率的提高。當(dāng)然這只是一個(gè)一般的原則，對(duì)于純度要求較高的產(chǎn)品如重組人白蛋白，不得不進(jìn)行多次純化。